腫瘤細胞的侵襲能力是腫瘤轉移的一個(gè)重要特征。為了研究腫瘤細胞侵襲過(guò)程的機制，一系列體外細胞實(shí)驗建立起來(lái)，用于研究細胞侵襲基底膜和基質(zhì)的過(guò)程。體外侵襲實(shí)驗首先是采用人工重構基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐漸凝固成膠，結構與天然基質(zhì)膜結構極為相似。通常的實(shí)驗是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel，細胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運動(dòng)才能穿過(guò)。實(shí)驗之后通過(guò)對穿過(guò)“基質(zhì)膜”的細胞進(jìn)行計數，來(lái)確定細胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細胞在生物狀態(tài)下的侵襲過(guò)程，但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性，使得直接觀(guān)察細胞偽足和骨架變化變得非常困難。

英國的科研人員改進(jìn)了腫瘤侵襲實(shí)驗，設計了一種環(huán)形細胞侵襲實(shí)驗，使得操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化，并且也能模擬3D侵襲。重要的是，能夠使侵襲過(guò)程中的活細胞或者是固定的細胞可視化。借用這個(gè)實(shí)驗方法，研究人員發(fā)現侵襲過(guò)程中主要有蛋白酶參與其中。研究發(fā)現，在3D侵襲的細胞中蛋白酶會(huì )聚集在偽足和細胞的粘附點(diǎn)上。

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

（一）實(shí)驗材料

• 細胞:   MDA-MB-231
• 實(shí)驗耗材:  傷口愈合插件         （ibidi，80209）

               玻璃底培養皿      （ibidi，81158） 

• 試劑:    Matrigel           （BD）

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

（二）實(shí)驗步驟

• 將ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養皿中間
• 在插件外部鋪 6 × 10⁵ MDA-MB-231細胞，等待細胞貼壁
• 細胞貼壁后移除傷口愈合插件，在細胞形成一個(gè)0.8cm²的空白區域
• 加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），將培養皿內層剛好鋪滿(mǎn)，能形成一個(gè)0.8mm厚度的“基質(zhì)膜”
• 孵育2小時(shí)，使Matrigel固化，加入培養基
• 在37^。C培養箱中孵育24小時(shí)。
• 以4%多聚甲醛溶液固定30分鐘，并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色

• 實(shí)驗結果

1、使用環(huán)形細胞侵襲實(shí)驗能夠觀(guān)測到細胞侵襲中的活動(dòng)（圖一）

圖一：MDA-MB-231細胞在環(huán)形細胞侵襲過(guò)程中形成了侵襲鏈：A）MDA-MB-231細胞在matrigel中形成了一個(gè)長(cháng)的侵襲鏈 B）勤洗臉的免疫熒光圖，紅色為Actin，藍色為細胞核

2. 使用環(huán)形侵襲實(shí)驗能夠記錄對比侵襲速率和侵襲面積（圖二）

圖二：MDA-MB-231細胞侵襲過(guò)程受MMP調控。加入25μM的GM6001能顯著(zhù)的減緩侵襲速率和侵襲面積。