美國的科研人員通過(guò)對TTF-1的調控發(fā)現，TTF-1能直接調節血管內皮生長(cháng)因子（VEGF），并且發(fā)現VEGF啟動(dòng)子上有多處TTF-1響應序列。 比如，VEGF的主要受體，VRGFR2顯示出收到TTF-1的直接正調節。本文中顯示，低氧并沒(méi)有促進(jìn) TTF-1+肺癌細胞中的VEGF的表達。而采用外泌體培養基或者是去外泌體的培養基（EDM）時(shí)，TTF-1都能促進(jìn)VEGF表達。但在研究中意外的發(fā)現TTF-1+肺癌細胞的去外泌體培養基（EDM-TTF-1+）能夠內皮細胞的血管形成。

研究人員采用HUVECs，鋪在基質(zhì)膠上，加入EDM以及VEGFR1等蛋白質(zhì)后孵育2-3小時(shí)，對比不同條件下的分枝數和節點(diǎn)數。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）實(shí)驗材料和實(shí)驗方法
1）細胞：       HUVECs                                 104 cells/50μl
2）培養基：      RPMI
3）基質(zhì)膠：    Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A)    10 µl per well
4) 試劑：     A549 conditioned media (EDM)
             Recombinant human GM-CSF protein（250ng/ml，Peprotech，300-03）
             sVEGFR1 protein（20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1)
             Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215)
             Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321) 
5）耗材：    ibidi血管生成載玻片  (ibidi, 81506) 
6）其他：        細格紙                                   
           

（二）實(shí)驗步驟
1）準備基質(zhì)膠
① 將10μl的Basement membrane以5mg/ml的濃度鋪入ibidi血管生成載玻片的內孔中，注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。
② 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
③ 準備一個(gè)10cm的培養皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
④ 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。
⑤ 37℃至少孵育30分鐘，使基質(zhì)膠固化。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動(dòng)性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿(mǎn)ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會(huì )影響到實(shí)驗的成像結果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿(mǎn)。

如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿(mǎn)，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿(mǎn)下孔的狀態(tài)。

3）鋪細胞

① 在培養好的HUVECs細胞的60mm培養皿中加入5μg 的 Calcein-AM，染色45分鐘。
② 胰酶消化細胞制成懸液，每孔種10000個(gè)細胞即可。準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。
③ 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
④ 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。
⑤ 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細胞的培養基，使上孔液體正好加滿(mǎn)。
⑥ 蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細胞都會(huì )沉下去落在Matrigel的表面。

4）不同培養基處理
采用EDM-EV，EDM-HDD，EDM-TTF-1處理細胞，并分別加入 rGM-CSF和rsVEGFR1，以Goat Ab和 Mouse Ab作為對照。37℃，培養2-3小時(shí)。
5）采集圖像并統計結果
使用尼康TS100顯微鏡的40倍鏡采集圖像，并且用 ImageJ對其分枝數和節點(diǎn)數進(jìn)行測量和統計。

三）實(shí)驗結果

如圖所示，使用EDM-TTF1處理的HUVECs血管生成被顯著(zhù)的抑制。當加入GM-CSF和VEGFR1后，血管生成也被顯著(zhù)的抑制，但當加入GM-CSF和VEGFR1的抗體后，血管生成的抑制也被取消，細胞又顯出很強的血管生成結果。說(shuō)明TTF-1上調了GM-CSF和VEGFR1的表達，抑制了血管生成的進(jìn)程。