Actin-肌動(dòng)蛋白是細胞骨架*的一個(gè)組成部分，其在很多基礎的細胞活動(dòng)中扮演著(zhù)非常重要的角色。尤其在細胞形態(tài)，遷移和研究細胞機制中，肌動(dòng)蛋白都是一個(gè)非常理想的觀(guān)測蛋白。肌動(dòng)蛋白是由小球狀的G-actin聚合成絲狀的F-actin動(dòng)態(tài)交互變化構成的，從而參與了細胞活動(dòng)中的各種細胞骨架的變化。通常研究活細胞中actin的活動(dòng)用的是轉染actin-GFP融合蛋白的質(zhì)粒，可以同時(shí)標記F-actin和G-actin，可以有效的反映出細胞骨架的相對活性，但是當值需要觀(guān)測F-actin的時(shí)候，使用actin-GFP會(huì )降低信噪比，難以專(zhuān)一捕捉F-actin的活動(dòng)。更有研究顯示，使用actin-GFP會(huì )直接影響細胞遷移和細胞分裂中的肌動(dòng)蛋白活性。

2015年英國的科研人員研究了幾種可以標記F-actin染料發(fā)現LifeAct是一種觀(guān)測F-actin非常理想的染料，其能特異性結合F-actin而不會(huì )影響肌動(dòng)蛋白的活性，能夠很好的顯現出肌動(dòng)蛋白的結構。LifeAct是一個(gè)17個(gè)氨基酸形成短肽，由于其很小，不會(huì )被哺乳動(dòng)物細胞當作外來(lái)蛋白清除，從而使一個(gè)非常理想的F-actin標記物。文中，以人間充質(zhì)干細胞（hMSCs， Human mesenchymal stem cells）為載體，研究LifeAct-GFP對比actin-GFP在觀(guān)測肌動(dòng)蛋白中的應用。

Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration

K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight

Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034

（一）實(shí)驗材料

• 細胞:     hMSCs            （STEMCELL Technologies，UK）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒    （ibidi， Germany）

             DMEM             （Gibco）

             Actin-GFP

             Lipofetamine LTX Plus     (Invitrogen)

             4%多聚甲醛溶液

             0.5%Triton X-100

  3) 耗材：玻璃管（外徑1mm，內徑0.58mm）

（二）實(shí)驗步驟

  1、LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染

• 使用未分化的hMSCs細胞轉染actin-GFP質(zhì)粒。
• 無(wú)抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培養細胞30min到1h
• 使用Lipofetamine LTX Plus轉染質(zhì)粒，按照說(shuō)明書(shū)將細胞在轉染培養基中培養6小時(shí)。
• 使用未分化的hMSCs細胞和，hMSCs細胞分化的永生化軟骨細胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒。

2、固定細胞的肌動(dòng)蛋白結構

使用Alexa Flour555-phalloidin標記F-actin

• 單層細胞貼壁染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞，用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
• 懸浮細胞染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染的細胞消化為單細胞，再在懸浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。

3、微管吸吮技術(shù)

• 將外徑1mm，內徑0.58mm玻璃管拉為內徑7-8μm的微管
• 使用注射泵維持微管內有0.76kPa的負壓
• 輕輕吸取細胞，每2秒采集一張圖片
• 細胞在微管負壓情況下會(huì )有不規則的突起，進(jìn)入微管，能很好的觀(guān)測F-actin的活動(dòng)。

• 實(shí)驗結果

1、鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位（圖一）

圖一：鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉染共定位：A、E）貼壁細胞中，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在標記F-actin時(shí)都表現很好，但是在懸浮細胞中，C、G）雖然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼筆環(huán)肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整個(gè)細胞中都有染色，因為其同時(shí)染G-actin沒(méi)有凸顯出F-actin。

2、微管吸吮技術(shù)使細胞發(fā)生形變，觀(guān)察F-actin活動(dòng)（圖二）

圖二：微管吸吮技術(shù)造成細胞形變。A）LifeAct-GFP可以很好的追蹤F-actin，會(huì )根據細胞的形變，標記到細胞突起的外緣的骨架；B）使用Actin-GFP標記沒(méi)有特異性，不能看到細胞變形中邊緣的骨架。