Eph和ephrin蛋白在協(xié)調細胞、細胞導向、細胞與細胞之間的相互作用中發(fā)揮著(zhù)非常重要的作用，與發(fā)展的組織模式和器官和血管生成都有關(guān)系。Eph家族成員在人類(lèi)腫瘤的發(fā)展過(guò)程中有著(zhù)非常關(guān)鍵功能，在正常的子宮內膜的血管化再生組織和人子宮內膜具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞（EMSC）有能檢測到Eph家族的蛋白表達，而其他高度血管化的人體器官卻沒(méi)有Eph的表達。澳大利亞的科學(xué)家發(fā)現，將EphA3+ or EphA3-depleted eSCs和tumour-derived endothelial cells (TECs)共培養時(shí)，EphA3+ eSCs不僅有更多的大細胞簇（15個(gè)細胞以上組成的）并且有更多的細胞簇。在添加 IIIA4這種Eph活化劑的時(shí)候，EphA3+ eSCs的細胞簇的數量有顯著(zhù)的降低。

Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth

C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes

PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106

（一）實(shí)驗材料和實(shí)驗方法

1）細胞：  EphA3+eMSCs                                 6 ×103cell/well

           EphA3-eSCs                                    6 ×103cell/well

           tumour-derived endothelial cells (TECs)         1.2 ×104cell/well

2）試劑：  5 mg/ml Alexa647 human/mouse chimeric (ch)IIIA4 antibody 

           Alexa647 human Fc as control （Jackson ImmunoResearch)

           5 mg/ml EphA3-Fc

           4% PFA/0.2% glutaraldehyde

           DAPI

3）基質(zhì)膠：    Matrigel (ECMatrix, Millipore)                  10 µl per well

4）耗材：      µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506) 

5）儀器：      AF6000 LX microscope (Leica)    10x tile scan imaging 

6）其他：      細格紙                                             1 sheet 

1. 實(shí)驗步驟

1. 準備基質(zhì)膠

1. 實(shí)驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過(guò)第二天緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel）

1. 開(kāi)始實(shí)驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
2. 打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。

1. 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：

由于Matrigel流動(dòng)性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿(mǎn)ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會(huì )影響到實(shí)驗的成像結果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿(mǎn)。

如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿(mǎn)，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿(mǎn)下孔的狀態(tài)。

1. 凝膠

1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2. 準備一個(gè)10cm的培養皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
3. 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。
4. 將整個(gè)培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。
5. 等待同時(shí)準備細胞懸液。

1. 鋪細胞

• 按照1:2的比例準備EphA3+eMSCs或EphA3-eSCs與tumour-derived endothelial cells (TECs)混合的細胞懸液（6 ×103cell/well：1.2 ×104cell/well）
• 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
• 每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。
• 蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細胞都會(huì )沉下去落在Matrigel的表面。

1. 不同培養基處理

采用5 mg/ml Alexa647-IIIA4 antibody或Alexa647-Fc 或5 mg/ml EphA3-Fc或培養基分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養多于18小時(shí)。

1. 采集圖像并統計結果

采集圖像并且統計細胞簇個(gè)數和細胞簇內細胞的個(gè)數。

1. 實(shí)驗結果

如圖所示，EphA3+ eMSCs細胞簇比EphA3-eSCs細胞簇更大，更多，并且內含15個(gè)細胞的細胞簇也越多。

當添加X-lkd IIIA4后，EphA3+ eMSCs細胞簇中大型細胞簇的比例有顯著(zhù)的下降。