在生物有機體內，鈣離子傳遞了各種各樣的胞內信號，這些信號幾乎在每種類(lèi)型的細胞中都存在，而且在很多方面都有非常重要的作用。在很多細胞活動(dòng)的時(shí)候，胞內鈣離子的濃度會(huì )顯著(zhù)升高。鈣離子成像是利用鈣離子特異染料，將細胞中的鈣離子濃度通過(guò)熒光強度表現出來(lái)，從而達到檢測細胞活動(dòng)的目的。德國的科學(xué)家通過(guò)研究B細胞胞質(zhì)中鈣離子濃度來(lái)研究 Rho GTPase Rac 對于B細胞功能的重要影響，研究發(fā)現，RacPLCγ2可以通過(guò)增強胞漿內的Ca2+濃度來(lái)影響B細胞受體（BCR）發(fā)揮作用。

文中，研究人員用BCR和Ca2+分別處理DT40 Bcell，觀(guān)測DT40B cell中鈣離子的濃度變化。研究人員研究了在這樣的處理下，Unmodified DT40 cells ( PLCγ2+/+), PLCγ2-/- cells，PLCγ2-/- cells stably expressing wild-type 這幾種細胞的鈣離子濃度變化，說(shuō)明了PLCγ2，Ca2+和BCR之間的關(guān)系。

Rac-mediated stimulation of phospholipase C-gamma-2 amplifies B cell receptor-induced calcium signaling

C. Walliser, K. Tron, K. Clauß, O. Gutman, A. Kobitski, M. Retlich, A. Schade, C. Röcker, Y. Henis, G. Nienhaus and P. Gierschik

Journal of Biological Chemistry, 2015, 10.1074/jbc.M115.645739

1. 實(shí)驗材料：

1. DT40 B細胞
2. Poly-L-Lysine          0.01%（w/v)
3. Fluo-4 AM             2μM
4. Pluronic F-127        0.02%（v/v）
5. RPMI 1640

1. Buffer B         20 mM Hepes/NaOH, pH 7.4；143 mM NaCl；6 mM KCl；1 mM MgSO4；5.6 mM glucose

1. CaCl2                1mM 
2. 六通道載玻片          無(wú)包被，德國ibidi公司，80601

圖一：ibidi六通道載玻片，可見(jiàn)載玻片上有六個(gè)平行通道，可以做六組平行實(shí)驗?；蛘哂貌煌臉颖?。通道載玻片的特點(diǎn)是單通道容積很小，需要的試劑量只有30μl。其底部可以直接使用油鏡，進(jìn)行高分辨率成像，光學(xué)效果。本文中，是使用共聚焦顯微鏡觀(guān)測鈣離子染料的熒光值。

1. 實(shí)驗步驟

• 使用0.01%（w/v)的多聚L賴(lài)氨酸（Poly L-Lysine）對六通道載玻片進(jìn)行包被
• 單通道鋪入3×105 DT40 B細胞，37℃,10%CO2環(huán)境中孵育45分鐘待細胞貼壁。
• 使用無(wú)細胞培養基，輕輕沖洗通道，移除未貼壁細胞（圖二）。

圖二：沖洗換液方法，藍色代表新的無(wú)細胞培養基

• 用RPMI 1640培養基加入2 µM fluo-4 AM, 0.02 % (v/v)Pluronic® F-127，加入通道中，孵育30分鐘。
• 用Buffer B沖洗兩次細胞，可以用加入 BCR抗體 anti-IgM或 1 mM CaCl2做為刺激液。
• 使用共聚焦顯微鏡觀(guān)測數據。

1. 實(shí)驗結果

圖三： 由圖中曲線(xiàn)可以看出，在沒(méi)有胞外Ca2+存在的時(shí)候，對BCR的刺激（加入 BCR抗體 anti-IgM）和B細胞中鈣離子活動(dòng)成比。而當有胞外Ca2+的時(shí)候（加入1mM CaCl2）胞外對于胞內鈣離子的活動(dòng)也有非常顯著(zhù)的影響，會(huì )隨著(zhù)Anti-IgM的升高，胞內鈣離子濃度會(huì )降低。