內皮細胞，內皮祖細胞，基質(zhì)細胞的信號在血管形成的時(shí)候是至關(guān)重要的。其中，外分泌體就是其中一種通信方式。有研究發(fā)現，外分泌體在免疫應答，腫瘤存活，應激反應和血管生成上的細胞間通信有著(zhù)非常重要的作用。在外分泌體中有mRNA和miRNA往往會(huì )對受體細胞產(chǎn)生影響。荷蘭的研究人員對外分泌體內的microRNA miR-214的研究發(fā)現，含有miR-214的外分泌體能夠抑制受體細胞的內皮細胞的衰老，并且促進(jìn)血管生成的發(fā)生。與此同時(shí)，其還會(huì )抑制毛細血管失調癥突變體 ataxia angiectasia mutated (ATM)的表達。

研究人員采用毛細血管內皮細胞系（he human microvascular endothelial cell line (HMEC-1)），鋪在基質(zhì)膠上，采用添加/無(wú)外分泌體的培養基培養18小時(shí)，對比不同條件下的小管長(cháng)度。

Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells

B. van Balkom, O. De Jong, M. Smits, J. Brummelman, K. den Ouden, P. de Bree, M. van Eijndhoven, D. Peg, W. Stoorvogel and T. Würdinger

Blood, 2013, 10.1182/blood-2013-02-478925

（一）實(shí)驗材料和實(shí)驗方法

1）細胞：  HMEC-1 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)    104 per well

2）培養基：      MCDB 131 Medium (Life Technologies)

3）基質(zhì)膠：      Matrigel (ECMatrix, Millipore)                           10 µl per well

4）耗材：        µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506)                1 Slide

5）其他：        細格紙                                             1 sheet 

實(shí)驗流程圖：

實(shí)驗流程圖，提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片 µSlide Angiogenesis 的下孔中，待膠凝后，將細胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀(guān)察。

（二）實(shí)驗步驟

1）準備基質(zhì)膠

①　實(shí)驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過(guò)第二天緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel）

②　開(kāi)始實(shí)驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

③　打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。

④　每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

怎么知道加了合適體積的Matrigel：
由于Matrigel流動(dòng)性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能10μl的膠不能填滿(mǎn)ibidi血管生成載玻片的下孔，這樣，必然會(huì )影響到實(shí)驗的成像結果。這時(shí)用一張格子紙就能知道移液槍調整到多少能正好把下孔填滿(mǎn)。

如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿(mǎn)，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿(mǎn)下孔的狀態(tài)。

2）凝膠

①　蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

②　準備一個(gè)10cm的培養皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。

③　將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。

④　將整個(gè)培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。

⑤　等待同時(shí)準備細胞懸液。

3）鋪細胞

加入細胞的量直接影響實(shí)驗結果，所以在正式實(shí)驗開(kāi)始之前，要對不同類(lèi)型的細胞和使用數量進(jìn)行預實(shí)驗。獲得佳比例的細胞密度。使用HMEC-1細胞，每孔種10000個(gè)細胞即可。

①　準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。

②　將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。

③　每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。

④　同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細胞的培養基，使上孔液體正好加滿(mǎn)。

⑤　蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細胞都會(huì )沉下去落在Matrigel的表面。

4）不同培養基處理

采用無(wú)處理基礎培養基（basal,-），培養了HMEC-124小時(shí)后收集的培養基（cond,comp.）和在基礎培養基中加入了分離出來(lái)的外分泌體的培養基（basal,+)分別加入血管生成載玻片中，37℃，培養18小時(shí)。

5）采集圖像并統計結果

可以按照細胞的生長(cháng)速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長(cháng)度測量和記錄，并且對其進(jìn)行統計分析。

三）實(shí)驗結果

結果可見(jiàn)，18小時(shí)后，分別測量3組實(shí)驗結果的血管長(cháng)度，統計后發(fā)現，加入外分泌體的基礎培養基和培養HMEC-1細胞24小時(shí)后收集的培養基的成管長(cháng)度，顯著(zhù)長(cháng)于純的基礎培養基中的HMEC-1細胞的成管長(cháng)度。說(shuō)明，外分泌體對血管生成有著(zhù)顯著(zhù)的促進(jìn)作用。