生物體內存在的機械力，比如流體剪切力對內皮細胞有著(zhù)非常多的影響。在血管中，不規則的亂流通常和血管的疾?。ū热?，動(dòng)脈粥樣硬化）是相關(guān)的，并且能直接影響內皮細胞的分化和凋亡。因此，2015年，瑞士的一個(gè)研究小組在淋巴管中研究不規則的剪切力的作用中發(fā)現，不規則的剪切力和轉錄因子FOXC2共同在在淋巴管形成中有著(zhù)非常關(guān)鍵的作用。在體外培養的淋巴管內皮細胞中，FOXC2受到振蕩剪切力的刺激會(huì )高表達，并且增強細胞間的，降低細胞的增殖率；而FOXC2的失活會(huì )使細胞對不規則的剪切力敏感，使細胞連接分解并且促進(jìn)細胞增值。文中，研究人員選擇4dyn/cm2每4秒變換流向的振蕩流（OSS，oscillatory shear stress)來(lái)模擬體內不規則的亂流。

FOXC2 and fluid shear stress stabilize postnatal lymphatic vasculature

A. Sabine, E. Bovay, C. S. Demir, W. Kimura, M. Jaquet, Y. Agalarov, N. Zangger, J. P. Scallan, W. Graber, E. Gulpinar, B. R. Kwak, T. Mäkinen, I. Martinez-Corral, S. Ortega, M. Delorenzi, F. Kiefer, M. J. Davis, V. Djonov, N. Miura and T. V. Petrova

The Journal of Clinical Investigation, 2015, 10.1172/JCI80454

一、實(shí)驗準備實(shí)驗材料及設備

1）細胞： lymphatic endothelial cells (LECs)

2）抗體：FOXC2 （大鼠抗人/小鼠，由Dr.N.Miura贈送，Miura et al, 1997, Genomics）

VE-cadherin (山羊抗人/小鼠，R&D（#AF1002））

Ki67 (兔抗人/小鼠，Abcam（#ab15580）

二抗 （Alexa 488-conjugated，Alexa 555-conjugate，Alexa 647-conjugated， Life Technologies）

3）培養耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.8 Luer （ibidi，Germany，80196）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             封口夾 

1. 儀器設備：ibidi流體剪切力系統，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

二、實(shí)驗方法

在實(shí)驗開(kāi)始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養箱中放置過(guò)第二天，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

按照下面流程鋪細胞：

1. 將LECs細胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿(mǎn)整個(gè)通道（圖一）。

2.蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細胞培養箱中培養半小時(shí)，等待細胞貼壁。細胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個(gè)注液孔中分別加入60μl培養基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養基（圖二）

3將通道載玻片再放入二氧化碳培養箱進(jìn)行培養24小時(shí)左右，等到細胞剛剛長(cháng)滿(mǎn)為單細胞層，即可開(kāi)始實(shí)驗。注意，要使用單層細胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗，使每個(gè)細胞均受到均勻的剪切力。

4靜置條件下細胞培養。在通道載玻片中靜置培養的細胞可以作為流體剪切力條件下培養的細胞對照。待流體實(shí)驗開(kāi)始的同時(shí)，將靜置細胞培養的對照組放入二氧化碳培養箱中進(jìn)行2天的培養。注意，培養過(guò)程中每天都要更換培養基。

二）搭建流體系統

1）將灌流管按照說(shuō)明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入12ml培養基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡，存留在灌流系統的氣泡會(huì )影響剪切力的大小，有時(shí)還會(huì )使灌流系統中的液體流動(dòng)停滯。打開(kāi)ibidi泵控制系統，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統將自動(dòng)運行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）

2）連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準備好的含貼壁細胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統中取下，放到超凈臺中。將通道載玻片的注液孔用培養基裝至過(guò)滿(mǎn)狀態(tài)(）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。

圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會(huì )有部分培養基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無(wú)塵紙將溢出的培養基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀(guān)測一下通道內的細胞狀態(tài)。

3）檢查灌流系統是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門(mén)。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲液管液面不會(huì )下降或者上升，那么，整個(gè)系統就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。

                    圖五

三）振蕩剪切力刺激，免疫熒光染色

• 以4 dynes/cm2；0.25 Hz（每4秒變換一次方向）刺激LECs細胞，進(jìn)行48小時(shí)的培養。靜置對照是直接將鋪有LECs的通道載玻片直接放在培養箱中培養48小時(shí)，每天換一次液。
• Ibidi通道載玻片具有非常出色的顯微成像效果，可以直接在通道內對處理的細胞和對照細胞進(jìn)行免疫熒光染色，并且成像。實(shí)驗結束后，輕輕吸出培養基，PBS清洗。
• 每通道以200μl的4%的多聚甲醛固定10分鐘，用PBS清洗。
• 每通道加入200μl的0.1% Triton® X-100通透3-5分鐘，用PBS清洗。
• 每通道加入200μl的1%BSA封閉20分鐘，用PBS清洗后，直接吸出所有液體。
• 在通道未干之前加入一抗，二抗，進(jìn)行常規的免疫熒光操作。
• 加入封片液，鏡檢觀(guān)測。

三 實(shí)驗結果

在振蕩剪切力的刺激下，研究人員檢測了FOXC2和細胞增殖生物標記物Ki67的表達情況。從圖上可見(jiàn)，在OSS的刺激下，FOXC2有非常顯著(zhù)的表達（粉色）而，代表細胞增殖的Ki67的表達則顯著(zhù)下降。與此同時(shí)針對VE-cadherin細胞聯(lián)合的染色表明，在有OSS刺激的情況下，VE-cadherin細胞聯(lián)合的面積明顯增大（右圖）。