導言

近幾年來(lái)，3D（three dimensional）細胞培養系統開(kāi)始成為生物學(xué)研究新的研究方法。使用3D系統培養系統能更好的模擬生物體內的真實(shí)生理環(huán)境，而2D（傳統的貼壁培養）細胞培養系統不能有效的模擬細胞在生物體內的生理環(huán)境。3D細胞技術(shù)有很多種方法，使用多細胞形成的細胞團是其中主要的研究應用之一。細胞團是微小的細胞聚集簇，可以用來(lái)研究3D情況下向外生長(cháng)的情況（細胞出芽）。

一.實(shí)驗原理

目前有幾種方法可以用來(lái)生成細胞團。 所有方法的原理都是防止細胞貼壁，并且創(chuàng )造環(huán)境增強臨近細胞間的細胞外基質(zhì)的粘附。這里我們提供的是一個(gè)液體膠的形式來(lái)形成細胞團。這是一種形成細胞團的非常簡(jiǎn)單的方法，有如下的優(yōu)勢：

1）可以形成單個(gè)細胞團，并且易于用顯微鏡觀(guān)測；

2）易于換液，可以進(jìn)行長(cháng)時(shí)間的培養；

3）這個(gè)方法操作簡(jiǎn)單，不需要額外的設備就能完成。

簡(jiǎn)單來(lái)講就是先在多孔板底部加入瓊脂糖，之后再加入細胞懸液。加入瓊脂糖不僅僅是提供了個(gè)疏水表面，細胞不會(huì )粘附，又提供了一個(gè)凹液面，細胞可以聚集在凹孔中，加大了細胞和細胞之間接觸的幾率，增強了細胞之間的粘附。

二.實(shí)驗材料

96孔板，平底（Corning 3370）

血管生成載玻片（德國ibidi，81506）

1.5%瓊脂糖（Sigma，A9539，使用PBS或者超純水配置）

胰酶

Matrigel

細胞培養基

三.成團實(shí)驗步驟

1）96孔板預處理

• 配置1.5%瓊脂糖，保持配好的瓊脂糖為液體狀態(tài)
• 96孔板每孔添加50μl配置好的1.5%瓊脂糖，室溫靜置20分鐘，待瓊脂糖冷卻固化。50μl瓊脂糖能剛好覆蓋96孔板單孔的底部，并且形成凹液面。
• 在96孔板的孔間加入無(wú)菌PBS，保證實(shí)驗的濕度

2.細胞成團

• 按照日常方法準備細胞懸液
• 根據試驗設計確定單孔需加入的細胞個(gè)數，本例中，每孔加入500個(gè)細胞
• 加入50-100μl的稀釋好的細胞懸液，保證每孔總液體體積（包括瓊脂糖）不超過(guò)200μl，每孔細胞數500個(gè)
• 培養箱中培養
• 每天都要換液，注意在細胞成團過(guò)程中不能劇烈晃動(dòng)培養板
• 可以用相差顯微鏡觀(guān)察細胞成團情況（圖一）。

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                  圖一：不同細胞系的成團過(guò)程（每孔500個(gè)細胞），比例尺 200μm。

四.出芽實(shí)驗及分析

實(shí)驗步驟：

1. 準備基質(zhì)膠

• 實(shí)驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過(guò)第二天緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel）
• 開(kāi)始實(shí)驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
• 打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。
• 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

2.凝膠 

• 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
• 準備一個(gè)10cm的培養皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
• 將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋。
• 將整個(gè)培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結。

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3.細胞出芽實(shí)驗及圖像分析

• 將形成的細胞團吸出，置于凝固的膠平面上
• 培養并使用顯微鏡采集出芽圖像
• 采用圖像分析軟件采集細胞團面積，出芽覆蓋面積，出芽個(gè)數以及總出芽長(cháng)度等數據。