很多童學(xué)做共聚焦成像的時(shí)候都會(huì )遇到細胞貼壁難的問(wèn)題。今天分享下如何處理玻璃底培養皿、如何選擇玻璃底培養皿，讓細胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時(shí)候能夠更得心應手。

   市面上常見(jiàn)的玻璃底培養皿，通常是在塑料培養皿底部打個(gè)洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細胞爬片用無(wú)影膠水或硅膠粘于培養皿底部。并不是整個(gè)培養皿的底部都是玻璃材質(zhì)的。適用于觀(guān)測的區域僅僅在打孔的區域。但是由于玻璃的疏水性，往往在培養細胞的時(shí)候，細胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長(cháng)狀態(tài)并不好，甚至在做共聚焦掃描成像的時(shí)候發(fā)生細胞脫片的現象。

圖1  市面常見(jiàn)玻璃底培養皿

    想要細胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養皿進(jìn)行細胞培養之前，要確認已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑。

自己動(dòng)手包被

     培養不同的細胞，需要的包被試劑也不同。同時(shí)，因為用于包被的蛋白是生物產(chǎn)物，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的，本技術(shù)帖只是提供參考，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說(shuō)明書(shū)。并且好以自己所用的試劑先做一個(gè)梯度實(shí)驗，找出適合的包被濃度。

     這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL，sigma，P4832, 100μg/ml）：

   PLL包被適用于絕大多數細胞，尤其適用于中樞系統神經(jīng)元的培養。在使用時(shí)需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達到理想的量。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2。需要根據包被面積，包被體積，來(lái)計算所需要蛋白質(zhì)的量。

    比如：35mm玻璃底培養皿，細胞生長(cháng)面積是3.5cm2，包被面積是4.1cm2，包被液體積是400μl，那根據推薦用量2μg/cm2。那么單孔中需要8.2μg的PLL，如果只加入400μl的PLL溶液，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）。所以，需要用超純水將原液進(jìn)行稀釋。

具體步驟：

1. 使用超純水按照1:5稀釋PLL原液。
2. 在每個(gè)35mm玻璃底培養皿中加入400μl的PLL稀釋液。
3. 室溫孵育1-2小時(shí)，吸出PLL稀釋液。
4. 使用2ml PBS溶液或無(wú)血清培養基小心的清洗3次，吸盡清洗液。
5. 直接加入細胞懸液進(jìn)行培養。

方法評價(jià)

    由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同，不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經(jīng)常由于需要對玻璃底培養皿包被，而產(chǎn)生了新的污染。而且污染往往是開(kāi)始養細胞了以后才會(huì )發(fā)現，這樣不僅耽誤了時(shí)間，而且也浪費了試劑盒耗材。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養皿價(jià)格也是不菲的（質(zhì)量不過(guò)關(guān)的玻璃底培養皿有可能會(huì )因為膠水沒(méi)有粘勻而漏液或者使用的膠水對細胞有毒性）。

無(wú)需包被的共聚焦培養皿

      對于想節省時(shí)間和功夫的童鞋，還是直接使用無(wú)需包被的共聚焦培養皿更為方便些。

     選擇合適的培養皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細胞貼壁、培養皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求。

     能符合上述因素要求的培養皿，不局限于帶包被的玻璃底培養皿，事實(shí)上，大家都知道塑料培養皿更便宜、相對玻璃來(lái)說(shuō)，也更容易讓細胞貼壁。這里以德國ibidi的共聚焦培養皿為例，說(shuō)一下符合共聚焦實(shí)驗的培養皿需要具備哪些參數：

圖2  德國ibidi共聚焦培養皿和高質(zhì)量玻璃底培養皿的底部參數對比

      可以看出，符合直接使用要求的共聚焦培養皿，它們的物理參數都是非常接近玻璃的，但同時(shí)，它們又還具有親水的特性，能讓大多數細胞更好貼壁；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好。比如這里舉例的ibidi培養皿，就可讓絕大多數細胞系和原代細胞直接貼壁生長(cháng)，而且不易碎，算是不錯的選擇。

   大家也可根據自己具體實(shí)驗要求，結合上述表格的參數，找到合適自己實(shí)驗的共聚焦培養皿。

方法評價(jià)

     選擇這類(lèi)培養皿，不需要額外包被，大大減少了污染的風(fēng)險。并且由于塑料底部比較易于加工，不需要膠水就能使其固定在培養皿底部。杜絕了漏液或者細胞毒性的可能。

高通量共聚焦實(shí)驗耗材

  由于單個(gè)培養皿通量很小，如果一次要做多個(gè)樣品，操作就會(huì )比較麻煩，且試劑用量會(huì )較大，這時(shí)候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔），可以滿(mǎn)足研究人員需要一次進(jìn)行多通量的成像。并且相對于傳統的共聚焦培養皿，腔室載玻片需要試劑的更少，非常節約價(jià)格昂貴的抗體，單孔實(shí)驗的成本大大降低。

圖3 市面的無(wú)需包被共聚焦培養皿和腔室載玻片

（圖片引用自德國ibidi的81156，80826）

      現在也有適用于高內涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板。適合全自動(dòng)成像和操作。

圖4  市面的高內涵顯微鏡和活細胞工作站的多孔板

（圖片引用自德國ibidi的82406，89626；這個(gè)多孔板的壁是黑色的，可以避免成像時(shí)候孔間熒光的影響，不錯的設計。贊一個(gè)～）

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