傷口愈合實(shí)驗--TARBP2的類(lèi)泛素化（SUMOylated）調節miRNA/siRNA作用

小RNA介導的基因沉默對于基因表達轉錄前調節尤其重要，但是，如何調節miRNA/siRNA的作用機理還并未研究清楚。上海交大醫學(xué)院的科研人員在2015年的NATURE COMMUNICATION上發(fā)的文章中研究調節miRNA/siRNA發(fā)揮作用的因子。研究表明，TARBP2的類(lèi)泛素化（SUMOylated）不會(huì )對成熟的的miRNA的產(chǎn)物有左右，但是會(huì )影響miRNA/siRNA的效用。其會(huì )引入Ago2來(lái)形成RNA沉默聚合體，并且會(huì )介導表達更多的miRNA前體結合到這一復合體上，從而進(jìn)一步介導RNAi。

傷口愈合實(shí)驗是體外研究細胞遷移的一個(gè)有用的實(shí)驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個(gè)空白的無(wú)細胞的地帶，然后對這個(gè)無(wú)細胞地帶的邊緣的細胞進(jìn)行觀(guān)察；這些邊緣的細胞會(huì )開(kāi)始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且終覆蓋整個(gè)無(wú)細胞的區域，重新互相接觸在一起。本研究中用到傷口愈合的實(shí)驗，使用TARBP2和pri-miR130b共表達，通過(guò)對傷口愈合的速度的影響，得出TARBP2-K52R可以抑制pri-miR130b對傷口愈合過(guò)程的影響。

SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.
Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J. 
Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899

在文中，使用Ibidi開(kāi)發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細胞種在插件中，等待細胞貼壁長(cháng)滿(mǎn)后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無(wú)細胞的“劃痕”。

（一）實(shí)驗材料
1)細胞:    serum starved A549luc stable cell line 
2)實(shí)驗耗材:   傷口愈合插件培養皿 (ibidi, 81176) 
3)細胞培養基:  DMEM   （Hyclone） 
4)試劑:  Lipofectamine 2000 （Invitrogen）
5)滅菌鑷子

（二）實(shí)驗步驟
1）鋪細胞（圖三）
?將ibidi傷口愈合培養皿底部的保護膠帶撕除。
?在ibidi細胞插件的每孔中加入5 × 103的細胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養皿。以防止細胞不均勻。
?在37。C培養箱中孵育24小時(shí)。

圖三：A. 去除培養皿底部的保護膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

2）形成“劃痕”
?采用無(wú)血清DMEM培養基培養細胞4小時(shí)
?如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。 
           
?移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
?小心的清洗細胞，之后加入2ml培養基進(jìn)行培養（圖五）。

3）采集并分析圖像
?在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向好是水平或者垂直。
?采集0h和10h的圖像，并且分析每張圖的細胞覆蓋劃痕區的面積。

（三）實(shí)驗結果

如圖所示，共表達pri-miR130b和TARBP2-WT（miR130b-WT）比單獨表達pri-miR130b（miR130b-con）對細胞遷移更有抑制作用，而將pri-miR130b和TARBP2-K52R（miR130b-K52R）共表達對于細胞遷移基本沒(méi)有抑制作用了。