細胞趨化實(shí)驗新方法（二）--實(shí)時(shí)觀(guān)察細胞動(dòng)態(tài)

案例：細胞作為趨化因子

上篇ibidi細胞趨化應用中（見(jiàn)鏈接：   ）以Dendritic cell對CCL19細胞趨化反應為例介紹了細胞趨化的新方法。

本案例將介紹如何用細胞作為細胞運動(dòng)的化學(xué)趨化因子。

如圖所示：觀(guān)測通道中可以使用貼壁細胞，或者是3D培養的細胞。用于趨化的細胞可以直接注入其中一個(gè)儲液池中（圖一）。

圖一：A待觀(guān)察細胞為貼壁細胞，受到左邊的儲液池中細胞影響具有了趨化行為。B待觀(guān)察細胞為3D培養細胞，在基質(zhì)膠中同樣也受到了儲液池中的細胞的影響具有趨化行為。

一、實(shí)驗材料準備：

1. 儀器：

• 細胞培養箱（高濕度，37℃，5%CO2）
• 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動(dòng)載物臺，自動(dòng)對焦系統
• 分析軟件：可選用手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動(dòng)的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數據統計分析。

1. 實(shí)驗材料準備：

實(shí)驗前一天準備工作：

為了減少ibidi細胞趨化載玻片與培養基中的氣泡，將載玻片和培養基提前24小時(shí)放入培養箱中

                                 表三：制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

操作步驟：

• 使用表一中的培養基制備  9 x 106 cells/ml 的細胞懸液
• 在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產(chǎn)生氣泡
• 在另一1.5ml離心管中準備150 μl  collagen I
• 使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
• 小心混勻（圖一B），避免產(chǎn)生氣泡
• 加入90μl細胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
• 小心混勻（圖一D），避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細胞-基質(zhì)膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì )破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時(shí)間，如果在凝膠后再進(jìn)行操作會(huì )破壞膠原纖維；3）當剛加10x MEM到NaHCO3中的時(shí)候會(huì )看到顏色變化，這表明沒(méi)有充分反應，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

1. 細胞趨化實(shí)驗

1. 趨化試劑

• 細胞趨化物：作為趨化因子的細胞    1-5 x 105 cells/ml   
• 培養基：建議使用同一種培養基，并且需要優(yōu)化一下血清濃度，建議使用低濃度的血清，減少由于血清造成的生長(cháng)因子而減弱了趨化造成的影響。

1. 實(shí)驗步驟

開(kāi)始細胞實(shí)驗之前，要準備一個(gè)濕盒將細胞趨化載玻片放在濕盒中?？梢杂靡粋€(gè)放了浸濕的紙巾的10cm培養皿作為濕盒（如圖二）。

貼壁細胞準備：

• 如圖，用小塞子將C、D、E、F塞緊。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細胞懸液。并使用同一個(gè)槍頭立即從B孔向外吸。直到觀(guān)測通道被細胞懸液充滿(mǎn)。
• 在注液孔中加入培養基到圖示位置（圖三(B)）。移走所有小塞子。將載玻片放在培養箱中等待細胞貼壁。

圖三：(A)示意向觀(guān)測通道中加入帶觀(guān)測細胞懸液。(B)圖表示注液孔的切面圖。

• 1-5小時(shí)后，用顯微鏡檢查細胞是否貼壁，如果貼壁，需要更換培養基。用小塞子將C、D、E、F塞緊。從A中加入10μl新鮮培養基。注意不要加入氣泡。同樣用同一個(gè)槍頭從B向外吸。
• 重復三次。
• 在注液孔中加入培養基到圖示位置（圖三(B)）。移走所有小塞子，將A、B孔塞緊，準備開(kāi)始趨化實(shí)驗。

圖四：細胞貼壁后用無(wú)細胞培養基更換觀(guān)測通道中的培養基。

3D細胞準備

• 如圖，用小塞子將C、D、E、F塞緊。使用20μl的槍頭從A中加入6μl細胞-基質(zhì)膠混合液。并使用同一個(gè)槍頭立即從B孔向外吸。直到觀(guān)測通道被細胞-基質(zhì)膠混合液充滿(mǎn)。
• 在注液孔中加入基質(zhì)膠到圖示位置（圖五(C)）。移走所有小塞子。小心將A、B孔塞緊，將載玻片放在培養箱中30-35分鐘，等待膠凝固后開(kāi)始趨化實(shí)驗。

圖五：(A)向觀(guān)測通道加入細胞-基質(zhì)膠混合液。(B)用同一個(gè)槍頭從另一個(gè)孔中向外細。(C)注液孔切面圖。(D)將A、B口塞緊，開(kāi)始趨化實(shí)驗。

加入趨化細胞：

• 細胞貼壁或膠凝固后，將C、D兩個(gè)孔用塞子塞緊。從E中加入65μl新鮮培養基，充滿(mǎn)整個(gè)儲液池。（圖六）
• 再小心移除C、D兩孔的塞子。把E、F兩孔塞緊，同樣的操作從C加入65μl培養基。
• 用20μl槍頭從C中加入15μl作為趨化因子的細胞懸液，用同一個(gè)槍頭從D中吸出15μl。
• 重復上步操作，加入總量30μl的細胞懸液。
• 將所有孔塞緊，靜置30分鐘后，就可以進(jìn)行圖像采集。

圖六：加入作為趨化因子的細胞。需先用無(wú)細胞的培養基將儲液池充滿(mǎn)，再逐漸加入細胞，加入后將所有塞子塞緊靜置一會(huì )，再開(kāi)始實(shí)驗。

●對照，在兩邊儲液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養基作為空白對照（-/-），和兩個(gè)儲液池均加入30μl細胞懸液作為陽(yáng)性對照（+/+）。
●按說(shuō)明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集。
●將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中，調整好采集位點(diǎn)，開(kāi)始錄制實(shí)驗結果。

三、圖像處理
1.手動(dòng)細胞軌跡追蹤
●下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
●導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開(kāi)模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開(kāi)始記錄細胞軌跡
●選擇一個(gè)細胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細胞，*點(diǎn)擊后，會(huì )有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細胞隨著(zhù)時(shí)間的新坐標
●統計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格
●至少收集30個(gè)細胞的軌跡才具有統計學(xué)意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì )而不能采集完整的軌跡的細胞
●可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導出

2）全自動(dòng)細胞軌跡追蹤
使用ibidi的WimTaxis自動(dòng)分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個(gè)工作日后，會(huì )得到細胞軌跡的坐標表格數據結果。

四、數據處理

使用遷移指數（ Forward Migration Indices*，FMIs）作為比較趨化實(shí)驗和對照試驗的參數。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數（FMI┴）應是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數（FMI‖）與0點(diǎn)有顯著(zhù)的區別表現出了化學(xué)趨向性。同時(shí)，使用Rayleigh Test**對細胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗。如果p值大于0.05表示了細胞運動(dòng)的無(wú)序性，表明沒(méi)有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)