細胞趨化實(shí)驗新方法：可實(shí)時(shí)觀(guān)察細胞動(dòng)態(tài)

細胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱(chēng)為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運動(dòng)。趨化性對細胞的發(fā)展和其他正常功能一樣*。

在這里，我們以小鼠樹(shù)突狀細胞為例，介紹一個(gè)細胞的化學(xué)趨化實(shí)驗。

一、實(shí)驗材料準備：

1. 儀器：

• 細胞培養箱（高濕度，37℃，5%CO2）
• 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時(shí)拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動(dòng)載物臺，自動(dòng)對焦系統
• 分析軟件：可選用手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動(dòng)的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數據統計分析。

1. 樹(shù)突狀細胞：

實(shí)驗前一天準備工作：

為了減少ibidi細胞趨化載玻片與培養基中的氣泡，將載玻片和培養基提前24小時(shí)放入培養箱中

將8-10天的樹(shù)突狀細胞用200 ng/ml LPS 過(guò)一個(gè)晚上處理（培養基等試劑見(jiàn)表一）

表一：細胞培養和活化所需的試劑盒培養基

*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)  

1. 基質(zhì)膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

樹(shù)突狀細胞的化學(xué)趨化實(shí)驗所需的試劑如下：

                                         表二：化學(xué)趨化需要的耗材和試劑

表三：制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

操作步驟：
●使用表一中的培養基制備  9 x 106 cells/ml 的細胞懸液
●在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產(chǎn)生氣泡
●在另一1.5ml離心管中準備150 μl  collagen 
●使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
●小心混勻（圖一B），避免產(chǎn)生氣泡
●加入90μl細胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
●小心混勻（圖一D），避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細胞-基質(zhì)膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì )破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時(shí)間，如果在凝膠后再進(jìn)行操作會(huì )破壞膠原纖維；3）當剛加10x MEM到NaHCO3中的時(shí)候會(huì )看到顏色變化，這表明沒(méi)有充分反應，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

1. 細胞趨化實(shí)驗

1. 趨化試劑

• 化學(xué)趨化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）
• 無(wú)化學(xué)趨化物培養基：RPMI1640，10%FCS

1. 實(shí)驗步驟

• 當細胞-基質(zhì)膠混合液制備好后直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）

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圖二，在觀(guān)測通道中加入細胞-基質(zhì)膠混合液

• 將細胞趨化載玻片放入培養箱中30-35分鐘，等待膠原蛋白凝固

膠凝固后，分別在兩邊儲液池中加入60μl的化學(xué)趨化物和無(wú)化學(xué)趨化物培養基作為細胞趨化實(shí)驗（+/-）（圖三）

圖三：加入化學(xué)趨化物（紅色）和無(wú)化學(xué)趨化物培養基（藍色）

在兩邊儲液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養基作為空白對照（-/-）（圖四

圖四：加入無(wú)化學(xué)趨化物培養基（藍色）作為空白對照

• 按說(shuō)明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
• 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中，調整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行4小時(shí)的觀(guān)測，每2分鐘采集一張圖片

圖五：明場(chǎng)1小時(shí)處圖像采集，由于是3D培養環(huán)境，不是所有的細胞都能被清楚的成像。

1. 圖像處理

1. 手動(dòng)細胞軌跡追蹤

• 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
• 導入采集的系列圖像到ImageJ中，打開(kāi)模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開(kāi)始記錄細胞軌跡
• 選擇一個(gè)細胞，按照時(shí)間點(diǎn)單擊細胞，*點(diǎn)擊后，會(huì )有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置，以后每次點(diǎn)擊，都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細胞隨著(zhù)時(shí)間的新坐標
• 統計完足夠的細胞軌跡后，保存軌跡坐標表格
• 至少收集30個(gè)細胞的軌跡才具有統計學(xué)意義，避免同一細胞追蹤兩次，去除由于凋亡會(huì )而不能采集完整的軌跡的細胞
• 可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導出

2）全自動(dòng)細胞軌跡追蹤

使用ibidi的WimTaxis自動(dòng)分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個(gè)工作日后，會(huì )得到細胞軌跡的坐標表格數據結果。

四、數據處理

使用遷移指數（ Forward Migration Indices*，FMIs）作為比較趨化實(shí)驗和對照試驗的參數。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數（FMI┴）應是在0點(diǎn)左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數（FMI‖）與0點(diǎn)有顯著(zhù)的區別表現出了化學(xué)趨向性。同時(shí)，使用Rayleigh Test**對細胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗。如果p值大于0.05表示了細胞運動(dòng)的無(wú)序性，表明沒(méi)有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

五、統計結果：

六、實(shí)驗優(yōu)勢總結

1.可實(shí)時(shí)觀(guān)察細胞趨化情況；

2.可計算細胞的趨化速率；

3.在1組實(shí)驗中即可做出連續性趨化濃度梯度；

4.建立的濃度梯度可維持長(cháng)達48小時(shí)，對快速遷移細胞或慢速遷移細胞都適用；

5.可選配套的圖像分析，輕松得到實(shí)驗數據。