Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室載玻片為實(shí)驗培養MCF-7細胞提供了一種簡(jiǎn)單且高效的實(shí)驗方案~

　　實(shí)驗方案：

　　細胞培養，固定，染色和成像觀(guān)察--都是在一個(gè)開(kāi)放型小室中搞定：

　　實(shí)驗步驟1：

　　必須在預實(shí)驗中確定細胞系的正確接種濃度。根據您的細胞類(lèi)型，用4-6x104細胞/ ml在2-3天內產(chǎn)生匯合的單層。

　　1.在無(wú)菌條件下，打開(kāi)8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）包裝。

　　2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計數細胞。細胞濃度為5×104細胞/ ml MCF-7。

　　3. 將400微升細胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因為這會(huì )導致細胞分布不均勻。

　　4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養。細胞至少培養24小時(shí)，或直到建立融合的單層。

　　實(shí)驗步驟2：

　　固定是染色程序的第一步。目標是將細胞，細胞形成物或組織維持在其當前狀態(tài)，并在較長(cháng)時(shí)間內通過(guò)化學(xué)試劑保存。

　　1.小心地吸出細胞培養基。

　　2.用PBS洗兩次。

　　3.加入400μl福爾馬林溶液。

　　4.在室溫下孵育30分鐘。

　　5.小心吸入福爾馬林溶液。

　　6.用PBS洗滌三次。

　　實(shí)驗步驟3：

　　應根據感興趣的細胞結構選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細胞的細胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。

　　1.準備你的染色溶液：PBS、DYE-490鬼筆環(huán)肽、DAPI 1μg/ml

　　2.小心吸出PBS。

　　3.移取400μl染色溶液到每個(gè)孔中

　　4.在室溫下避光孵育30分鐘

　　實(shí)驗步驟4：

　　染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號

　　1.小心地吸出染色溶液

　　2.加入400μl緩沖液

　　3.小心地吸出緩沖液

　　4.重復步驟2和步驟3至少一次

　　實(shí)驗步驟5：

　　從一個(gè)邊緣開(kāi)始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應以緩慢，穩定的進(jìn)行，以避免損壞細胞層?！　?/span>

　　實(shí)驗步驟6：

　　完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。

　　1.將載玻片側面在干凈的實(shí)驗室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。

　　2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　3.等封片劑固定好?！　?/span>

　　實(shí)驗步驟7：顯微觀(guān)察　　

　　在可移除8孔腔室載玻片中免疫染色的MCF-7細胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白，紅色：F-肌動(dòng)蛋白（鬼筆環(huán)肽），藍色：細胞核 (DAPI)。使用20倍物鏡拍攝寬場(chǎng)熒光圖像。

　　ibidi提供了一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟高效的方案，使用一片可移除的腔室載玻片可進(jìn)行細胞的培養，固定和染色，無(wú)需爬片，是倒置/正置顯微鏡以及長(cháng)期樣品儲存的理想選擇。

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