此次實(shí)驗是以HUVEC細胞為例，來(lái)介紹腫瘤學(xué)血管生成實(shí)驗的操作過(guò)程這一實(shí)驗的詳細過(guò)程。

圖一  血管生成鏡檢圖

　　實(shí)驗步驟：

　　1、準備基質(zhì)膠　　

　　1）實(shí)驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱，使膠能過(guò)夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4℃預冷的槍頭用于吸取Matrigel）　　

　　2）開(kāi)始實(shí)驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中?！　?/p>

　　3）打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片?！　?/p>

　　4）每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

　　由于Matrigel流動(dòng)性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿(mǎn)血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì )影響到實(shí)驗的成像結果。

　　如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：　　

　　我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調整到多少能正好把下孔填滿(mǎn)。

　　如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿(mǎn)，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿(mǎn)下孔的狀態(tài)。

　　2  凝膠　

　　1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子?！　?/p>

　　2）準備一個(gè)10cm的培養皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒?！　?/p>

　　3）將ibidi血管生成載玻片放入培養皿中，蓋上培養皿蓋?！　?/p>

　　4）將整個(gè)培養皿放入培養箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結?！　?/p>

　　5）等待同時(shí)準備細胞懸液。

　　3  鋪細胞　

　　加入細胞的量直接影響實(shí)驗結果，所以在正式實(shí)驗開(kāi)始之前，要對不同類(lèi)型的細胞和使用數量進(jìn)行預實(shí)驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實(shí)驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個(gè)細胞即可?！　?/p>

　　1）準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻?！　?/p>

　　2）將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出?！　?/p>

　　3）每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠??！　?/p>

　　4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細胞的培養基，使上孔液體正好加滿(mǎn)?！　?/p>

　　5）蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細胞都會(huì )沉下去落在Matrigel的表面。

　　4  采集圖像并統計結果　　

　　可以按照細胞的生長(cháng)速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長(cháng)度，覆蓋面積，成環(huán)數，結點(diǎn)數進(jìn)行測量和記錄，并且對其進(jìn)行統計分析。

　　5  免疫熒光染色　　

　　根據需要，可以對成管結果進(jìn)行免疫熒光染色?！?/p>

　　1）小心的移除上孔內培養基，注意不要碰到膠或者細胞網(wǎng)絡(luò )?！　?/p>

　　2）加入50μl用無(wú)血清培養基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)?！?/p>

　　3）在室溫下避光孵育30分鐘?！　?/p>

　　4）使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞?！　?/p>

　　5）使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像?！?/p>