此次實(shí)驗便是應用了ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上分析MCF-7細胞遷移實(shí)驗的詳細方案，為傷口愈合實(shí)驗提供了完整的解決方案，并進(jìn)行測試了五種不同濃度的人表皮生長(cháng)因子（hEGF）對遷移行為的影響并與對照條件進(jìn)行比較。

　　實(shí)驗工作流程：

　　3.1 步驟1：細胞接種　　

　　正確的接種濃度是一個(gè)關(guān)鍵參數，因為24小時(shí)后應達到匯合的單層。需要進(jìn)行預實(shí)驗以確定所用細胞系的最佳濃度。

　　1. 取下附在μ-Plate底部的保護膜?！?/p>

　　2. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將MCF-7細胞懸浮液調節至細胞濃度為5×105細胞/ml?！　?/p>

　　3. 將70μl細胞懸浮液應用于2孔的培養插件每個(gè)孔中。避免搖動(dòng)μ-Plate，因為這會(huì )導致細胞分布不均勻?！　?/p>

　　4. 將細胞在37°C和5％CO2培養至少24小時(shí)?！　?/p>

　　圖2在開(kāi)始細胞接種步驟（A）之前取下保護膜。將70μl細胞懸浮液填充到2孔培養插件（B）的每個(gè)孔中。

　　3.1 步驟2：劃痕形成

　　μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實(shí)驗條件可以進(jìn)行四次技術(shù)重復.　

　　1. 在顯微鏡下觀(guān)察培養24小時(shí)后的細胞密度。如果24小時(shí)后未達到融合細胞單層，則將μ-Plate于細胞培養箱中再培養幾個(gè)小時(shí)。定期檢查匯合點(diǎn)?！　?/p>

　　2. 將生長(cháng)因子添加到細胞培養基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF?！　?/p>

　　3. 用無(wú)菌鑷子輕輕取出2孔培養插件。要移除培養插件，請抓住一個(gè)角，如圖3所示?！　?/p>

　　4. 用無(wú)細胞培養基或PBS洗滌細胞層以除去細胞碎片和未附著(zhù)的細胞?！　?/p>

　　5. 小心吸出無(wú)細胞培養基或PBS?！?/p>

　　6.用移液管將1ml細胞培養基加到24孔板的每個(gè)孔中。

　　圖3使用無(wú)菌鑷子取出2孔培養插件

　　3.1 步驟3：獲取顯微鏡圖像　　

　　我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴(lài)性和細胞遷移的特征?！　?/p>

　　1. 將μ-Plate 24孔培養板放在顯微鏡上并確定所有24個(gè)孔的位置?！　?/p>

　　2. 在接下來(lái)的幾個(gè)小時(shí)內多次拍攝圖像，開(kāi)始觀(guān)察過(guò)程。在24小時(shí)內每30分鐘拍攝一次圖像?！　?/p>

　　4.結果　

　　分析顯微圖像以獲得關(guān)于培養細胞遷移特征信息。分析細胞覆蓋區域隨時(shí)間的變化來(lái)確定細胞速度。

　　圖4 hEGF對MCF-7細胞遷移行為影響的比較。測試了四種不同的EGF濃度，并與對照實(shí)驗進(jìn)行了比較。

　　使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上進(jìn)行測試六種不同（或更多）的條件。通過(guò)比較細胞速度與對照條件的速度來(lái)分析五種不同hEGF濃度（每種重復四次）的影響。實(shí)驗數據顯示，與對照組相比，hEGF增加了MCF-7細胞的細胞速度。如圖4所示，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細胞速度沒(méi)有進(jìn)一步增加。