如何創(chuàng )建令人驚嘆的細胞球體3D圖像

　　第一部分：µ-Slide球體灌注中的球體形成和培養

　　請在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無(wú)菌條件下執行。

　　開(kāi)始實(shí)驗之前，在標準細胞培養瓶（例如 T75）中制備 L929 成纖維細胞，細胞粘附在底部。細胞在實(shí)驗當天應該是健康的并且*佳亞匯合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培養箱內過(guò)夜平衡所有必需的材料，例如載玻片、培養基和管道（灌注套件）。平衡對于防止氣泡隨著(zhù)時(shí)間的推移而出現至關(guān)重要。

　　1. 將60 µl 無(wú)細胞培養基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每個(gè)通道（根據說(shuō)明用提供的蓋玻片封閉）　　

　　2. 在培養箱中 37°C 孵育 2 小時(shí)。孵育期間始終關(guān)閉蓋子?！　?/p>

　　3. 用 Accutase 處理培養的 L929 細胞 1-2 分鐘以使其脫離?！　?/p>

　　4. 收集細胞懸液，離心，在培養基中稀釋?zhuān)涣咳Q于所需的細胞濃度?！　?/p>

　　5. 對細胞計數并調整至終濃度為 5 x 105cells/ml?！?/p>

　　6. 用無(wú)細胞培養基沖洗 µ-Slide 球體灌注的通道，以去除潛在的氣泡?！　?/p>

　　7. 將 45 µl 細胞懸液直接移入每個(gè)通道?！　?/p>

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小時(shí)，使細胞在壁孔中沉淀?！　?/p>

　　9. 用60 µl 無(wú)細胞培養基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的儲液庫?！　?/p>

　　10. 在 37°C 下孵育過(guò)夜以形成球體?！　?/p>

　　11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡，請用無(wú)細胞培養基小心沖洗通道?！　?/p>

　　12. 使用ibidi 串行連接器連接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個(gè)通道　　

　　13. 根據ibidi 泵系統、流體單元和灌注裝置指示?！　?/p>

　　14. 將µ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統并開(kāi)始流動(dòng)。使用盡可能低的流速（5 mBar 氣壓導致流速為 0.74 ml/min）。進(jìn)行實(shí)驗，直到球體具有所需的成熟狀態(tài)，在這種條件下培養 7 天后?！　?/p>

　　圖1：L929 成纖維細胞在孔中形成球體并在流動(dòng)條件下培養

　　圖 2：L929 成纖維細胞在µ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系統灌注，0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，井徑 800 µm。

　　第二部分：L929 球體的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中進(jìn)行。在開(kāi)始染色之前，請閱讀指示并遵循載玻片中關(guān)于一般移液和更換溶液的建議。

　　1. 當 L929 球體培養達到所需的成熟狀態(tài)（此處為 7 天后）時(shí)，小心地斷開(kāi) µ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統的連接?！　?/p>

　　2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘?！　?/p>

　　3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時(shí)?！　?/p>

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過(guò)夜。從這一點(diǎn)開(kāi)始，保持載玻片避光。圖 3A 顯示了清除前的球體成像?！　?/p>

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗細胞一次?！　?/p>

　　6. 通過(guò)在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘，依次使球體脫水?！　?/p>

　　7.  在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘?！　?/p>

　　8.  從冰中取出載玻片，讓它升溫至 RT?！　?/p>

　　9.  執行清除：在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個(gè)階段，球體可以避光儲存數周，而不會(huì )顯著(zhù)損失熒光?！　?/p>

　　10.  使用共聚焦顯微鏡的圖像球體（參見(jiàn)圖 3）?！　?/p>

　　圖 3：清除前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡（紅色：鬼筆環(huán)肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球體。請注意，由于光散射和吸收，只能看到外圍細胞，而看不到中心的細胞。(B, C) 清除后的球體。請注意，清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過(guò)程，同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的清除允許即使在球體成纖維細胞的中心也可以看到細胞，同時(shí)保留球體的形態(tài)。細胞核的計數甚至可以確定形成該球體的細胞數。

　　注：此實(shí)驗方案來(lái)自ibidi的實(shí)際用戶(hù)，更多詳情可聯(lián)系本文作者　　

　　僅供科研使用！