2D細胞外基質(zhì)（ECMs）的物理特性會(huì )影響到細胞的粘附動(dòng)態(tài)和形態(tài)，但是3D細胞外基質(zhì)的局部微環(huán)境對細胞的影響卻知之甚少。美國的科研人員構建了幾種3D膠原基質(zhì)，研究其微結構的變化對于調節3D狀態(tài)下的細胞粘附動(dòng)態(tài)和細胞遷移的影響。細胞外基質(zhì)中有各種成束的纖維會(huì )加強局部可粘位點(diǎn)的堅固性，并且可以通過(guò)ECM/粘附偶聯(lián)點(diǎn)增強細胞的粘附穩定性，并且高度柔軟的網(wǎng)狀聯(lián)合促進(jìn)了粘附的收縮力。3D粘附的動(dòng)力學(xué)由局部的ECM的強度和整合素/ECM還有II型肌球蛋的收縮白共同調節。不同于2D遷移，3D的細胞遷移不僅受ECM孔徑大小影響。

科研人員需要觀(guān)察活細胞的在成束的纖維中細胞前沿的突出點(diǎn)的形態(tài)變化，和細胞運動(dòng)的軌跡。使用LifeAct標記細胞的F-actin能夠不影響細胞功能和行為的情況下對細胞進(jìn)行觀(guān)測。研究人員發(fā)現細胞會(huì )將細胞前進(jìn)的邊緣沿著(zhù)成束的纖維長(cháng)邊移動(dòng)。具有接觸導向的作用，這一點(diǎn)在纖維和細胞前進(jìn)邊緣平行時(shí)尤為明顯。而纖維母細胞在不同的ECM中也顯示出了類(lèi)似的特性，是將纖維拉向細胞自身的同時(shí)將偽足向前延伸，并遷移的。

Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions

Andrew D. Doyle，Nicole Carvajal, Albert Jin，Kazue Matsumoto& Kenneth M. Yamada

Nature Communications 6, Article number: 8720 doi:10.1038/ncomms

（一）實(shí)驗材料

• 細胞:     fibroblast            （gift from NIDCR/NIH）
• 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒    （ibidi， Germany）

             Phenol red-free DMEM      （Hyclone）

             FBS                        （Hyclone）

             L-glutamine           (GIbco)

             Anti-collagen I         ( Millipore,1:200, Cat# ABT-123)

• 儀器：   電轉儀                 (Bio-Rad Gene Pulsar TM)

（二）實(shí)驗步驟

  1、LifeAct-GFP轉染

 使用0.4cm的電擊杯，設定電壓為170V, 960uFd，持續時(shí)間17-22μs。

  2、collagen I 預染

• 5ml 的3mg/ml的collagen1在室溫固化
• 之后，膠置于50mM的硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）中孵育10min
• 室溫避光條件下使用灌流管逐漸用含有NHS脂染料的硼酸鹽溶液逐漸替換之前的緩沖液并孵育1小時(shí)。
• 保持染料一直處于灌流的狀態(tài)，并且在孵育用TRIS溶液沖洗10分鐘，并用PBS沖洗數小時(shí)移除沒(méi)有結合的染料
• 使用200mM的鹽酸溶解已凝固的膠知道所有的膠溶解
• 以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述膠溶液4小時(shí)
• 實(shí)驗前，用標記過(guò)的collagen I替換2-4%的未標記的collagenI，并和細胞混勻，開(kāi)始試驗。

• 實(shí)驗結果

如圖所示：表達EGFP-LifeAct的fibroblast（綠色或灰色）在FB4 ECM（紅色）中的活細胞成像實(shí)驗。從時(shí)間序列的拍攝結果可以看出，細胞一直是沿著(zhù)纖維的方向，將actin富集到細胞的絲狀偽足（白箭頭）中，控制細胞的遷移方向。星號代表了一條膠原纖維起止位置，青色的線(xiàn)作為其位置的參照物表明，細胞是通過(guò)將纖維拉向自己的方式來(lái)向前移動(dòng)的。