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可視的細胞趨化實(shí)驗

更新時(shí)間:2016-06-17   更新時(shí)間:2016-06-17   點(diǎn)擊次數:3962次

細胞趨化性(Chemotaxis,亦被稱(chēng)為化學(xué)趨向性)是趨向性的一種,指細胞、細菌及其他單細胞、多細胞生物依據環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運動(dòng)。趨化性對細胞的發(fā)展和其他正常功能一樣*。

在生物材料移植的時(shí)候,快速的纖維血管化是成功移植的先決條件之一。尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和組織型纖溶酶原激活物(tPA)或纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)在纖維蛋白溶解中都發(fā)揮了重要的作用。這三種蛋白近均被報道在無(wú)可溶纖維蛋白的細胞過(guò)程中有表現出*的作用,比如細胞粘附,遷移和增殖。

德國的科研人員發(fā)現使用內皮細胞做趨化實(shí)驗,發(fā)現uPA,tPA和PAI-1對內皮細胞的趨化遷移行為都有顯著(zhù)的影響。

 

 

Components of the plasminogen activation system promote engraftment of porous polyethylene biomaterial via common and distinct effects.

Reichel CA, Hessenauer ME, Pflieger K, Rehberg M, Kanse SM, Zahler S, Krombach F, Berghaus A, Strieth S.
PloS one, 2015, 10.1371/journal.pone.0116883

 

 

一、實(shí)驗材料準備:

 

  • 倒置顯微鏡,具有4X相差物鏡和定時(shí)拍照功能(Nikon)
  • 鏡載加熱孵育系統(37,5%CO2
  • 可選配置:全自動(dòng)載物臺,自動(dòng)對焦系統
  • 分析軟件:手動(dòng)分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數據統計分析。
  • HUVEC 細胞  (Human umbilical vein endothelial cells from Promocell)
  • tPA,uPA,PAI-1 (Sino Biological)
  • Matrigel (Corning)
  • ECGM培養基 (Promocell)
  • 細胞趨化載玻片(圖一)        (ibidi)

 

圖一,ibidi 細胞趨化載玻片圖示,如圖所示,細胞種在中間通道,兩邊的儲液池可以放不同的刺激因子,從中間通道的觀(guān)測可以得到細胞對刺激因子的趨向性,本例是使用一邊加入uPA、tPA或PAI-1,另外一邊放入培養基作為實(shí)驗組,兩邊都放培養基作為對照組。

 

 

  • 細胞趨化實(shí)驗

 

 

  1. 實(shí)驗步驟

 

  • 將細胞與30%Matrigel的ECGM稀釋液混合,密度為3×106 cells/cm2,直接加入ibidi細胞趨化載玻片的中間通道中(圖二)

 

圖二,在觀(guān)測通道中加入細胞-基質(zhì)膠混合液

  • 將細胞趨化載玻片放入培養箱中30-35分鐘,等待膠凝結
  • 膠凝結后后分別在兩邊儲液池中加入60μl的30 ng/mL的uPA、20 ng/mL的tPA或1 μg/mL的PAI-1和無(wú)化學(xué)趨化物培養基作為細胞趨化實(shí)驗(+/-)(圖三)

圖三:加入X-lkd IIIA4抗體(紅色)和無(wú)化學(xué)趨化物培養基(藍色)

在兩邊儲液池中均加入60μl的無(wú)化學(xué)趨化物培養基作為空白對照(-/-)或均加入趨化因子為陽(yáng)性對照(+/+)(圖四)

圖四:加入無(wú)化學(xué)趨化物培養基(藍色)作為空白對照

 

  • 按說(shuō)明,將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
  • 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統中,調整好采集位點(diǎn),進(jìn)行20小時(shí)的觀(guān)測,每10分鐘采集一張圖片

 

  • 圖像數據處理
  1. 手動(dòng)細胞軌跡追蹤
  • 下載ImageJ,并安裝Manual Tracking模塊
  • 導入采集的系列圖像到ImageJ中,打開(kāi)模塊“Manual Tracking”,選擇“Add track開(kāi)始記錄細胞軌跡
  • 選擇一個(gè)細胞,按照時(shí)間點(diǎn)單擊細胞,*點(diǎn)擊后,會(huì )有新窗口跳出來(lái)顯示初始位置,以后每次點(diǎn)擊,都將在這個(gè)新窗口中產(chǎn)生一個(gè)該細胞隨著(zhù)時(shí)間的新坐標
  • 統計完足夠的細胞軌跡后,保存軌跡坐標表格
  • 至少收集30個(gè)細胞的軌跡才具有統計學(xué)意義,避免同一細胞追蹤兩次,去除由于凋亡會(huì )而不能采集完整的軌跡的細胞

 

四、實(shí)驗結果:

 

圖五:uPA,tPA和PAI-1對內皮細胞的趨化遷移行為的影響。A)為在趨化因子存在下,HUVEC細胞的趨向性運動(dòng)軌跡。B)為統計分析結果說(shuō)明,HUVEC細胞對uPA,tPA和PAI-1都有證趨向行為。

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