傷口愈合測定是一種研究體外細胞遷移的簡(jiǎn)單方法。ibidi Culture-Insert 傷口愈合插件系列產(chǎn)品為傷口愈合實(shí)驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需四個(gè)步驟。

　　本應用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well傷口愈合插件分析MCF-7細胞遷移的詳細方案。

圖 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行傷口愈合測定的實(shí)驗工作流程

　　實(shí)驗操作流程：

　　步驟1:細胞接種

　　為建立可靠的數據采集系統，須在實(shí)驗開(kāi)始前確定實(shí)驗參數。例如：選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用24小時(shí)后產(chǎn)生百分之100光學(xué)融合細胞層的密度。

　　1.像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟，以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸浮液調節至約3x105個(gè)細胞/ml的細胞濃度，以在24小時(shí)后獲得融合的細胞層。

　　2. 將70µl細胞懸液滴入培養皿2孔插件的每個(gè)孔中。避免搖晃µ-Dish培養皿，因為這將導致細胞分布不均勻。

　　3. 將細胞在37°C和百分之5 CO2下培養至少24小時(shí)。

圖2. 在高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿中接種細胞

　　步驟2:劃痕形成

　　融合細胞層是開(kāi)始該測定的先決條件。移除高壁傷口愈合2孔插件培養皿后加入新鮮培養基。如有必要，在培養基中補充抑制或增強物質(zhì)，以評估其對細胞遷移行為的影響。

　　1. 24小時(shí)后在顯微鏡下檢查細胞密度。如果24小時(shí)后仍未形成細胞融合層，則將µ-Dish培養皿再次放入細胞培養箱中再培養12-24小時(shí)。定期檢查匯合處。

　　2. 用無(wú)菌鑷子輕輕取出傷口愈合2孔插件培養皿。如圖3所示，用鑷子輕輕夾住插件的一角取出插件。

圖3.使用無(wú)菌鑷子移除傷口愈合2孔插件培養皿

　　3.移除插件后，檢查細胞層是否仍附著(zhù)在μ-Dish培養皿的表面。

　　4.用無(wú)細胞培養基或PBS清洗細胞層，去除細胞碎片和未附著(zhù)的細胞。

　　5.推薦使用體積為2mL的無(wú)細胞培養基填充μ-Dish培養皿。

圖4. 由高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿創(chuàng )建的無(wú)細胞間隙

　　步驟3：獲取顯微鏡圖片：

　　我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴(lài)性和細胞遷移的特征。

　　1. 將培養皿放在顯微鏡上并移動(dòng)，直到圖像中捕捉到間隙和兩個(gè)細胞的正面。使用4x/5x或10x物鏡。傷口區域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

　　2. 在接下來(lái)的幾個(gè)小時(shí)內，通過(guò)多次拍攝圖像開(kāi)始觀(guān)察過(guò)程。

　　3. 以30分鐘的時(shí)間間隔對在ibiTreat表面上培養的MCF-7細胞進(jìn)行20小時(shí)的時(shí)間推移測量。

圖5.使用MCF-7細胞的遷移測定的時(shí)間流逝測量

　　步驟4：使用FastTrack AI和數據解釋進(jìn)行定量圖像分析

　　必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養細胞的遷移特征的信息。這可以通過(guò)使用圖像處理軟件手動(dòng)完成，也可以通過(guò)使用ibidi提供的傷口愈合快速通道人工智能圖像分析進(jìn)行自動(dòng)圖像分析。

　　這里顯示的示例數據是使用FastTrack AI進(jìn)行分析的。自動(dòng)圖像分析檢測細胞覆蓋面積。繪制細胞覆蓋面積隨時(shí)間的變化圖，顯示間隙閉合的過(guò)程。線(xiàn)性相位可以用來(lái)表征遷移(=傷口閉合的速度)。

　　線(xiàn)性相的斜率顯示，劃痕閉合的平均速度為0.0184*106µm2/小時(shí)（=0.44*106µm2/天）。

圖6. FastTrack AI對傷口愈合實(shí)驗的定量圖像分析

　　高壁預置傷口愈合2孔插件培養皿放置在細胞培養表面上，提供兩個(gè)細胞培養庫，每個(gè)庫由一條500μm壁隔開(kāi)。在兩個(gè)儲液庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在設置區域生長(cháng)。移除培養插件在適當的細胞附著(zhù)后，產(chǎn)生大約500 μm的無(wú)細胞間隙。

　　在顯微鏡評估傷口愈合過(guò)程。根據您感興趣的焦點(diǎn)，可以通過(guò)使用視頻顯微鏡或通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察圖像來(lái)完成。測量細胞覆蓋區域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。