細胞內的鈣稱(chēng)為細胞內鈣，可受到高度調節；這種緊密的調節使細胞內鈣成為了解細胞功能和信號動(dòng)力學(xué)的較佳的工具，使其能夠在細胞遷移、交流和對刺激物或異物作出反應的能力。

　　鈣：細胞過(guò)程的多功能指示劑

　　鈣信號可作為讀數來(lái)了解病毒在感染過(guò)程中利用宿主信號反應的能力，并剖析所涉及的信號通路。有幾種細胞內鈣的熒光指示劑是可用于研究細胞功能；能夠檢查傷口愈合、傳染病、藥物治療等過(guò)程中的細胞反應。為此可利用含有熒光鈣指示劑的細胞的活細胞成像，其中熒光的增加表明細胞內鈣的增加。

　　鈣指示劑的種類(lèi)及其應用

　　鈣指示劑主要分為兩大類(lèi)：化學(xué)指示劑和基因編碼的鈣指示劑?？捎糜诨罴毎上駥?shí)驗的鈣指示劑類(lèi)型取決于預期的細胞系、成像長(cháng)度以及定性或定量數據的預期結果等因素。

　　1.預期細胞系：

　　對于原代細胞系直接的方法是使用熒光染料，將熒光鈣指示劑簡(jiǎn)單地添加到培養的細胞中，并在孵育期后成像。

　　與基因編碼的鈣指示劑相比，熒光染料通常更亮、更穩定。在活細胞成像中，熒光染料可以有效地進(jìn)行短期活細胞成像，但隨著(zhù)時(shí)間的推移細胞有排出染料的趨勢。鈣染料的一個(gè)重要考慮因素是使用抑制劑還是激動(dòng)劑。抑制劑和激動(dòng)劑也可能影響鈣染料反映，類(lèi)似于在天然組織中的表達。

　　在廣泛的鈣信號傳導實(shí)驗中，已建立的細胞系是可以被轉導以表達遺傳編碼的鈣指示劑，如GCaMP、黃色cameleon等。對現有的不同基因編碼鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn)，使指示劑更亮，光穩定性更好，動(dòng)態(tài)范圍更大，從而提高了鈣的敏感性。慢病毒轉導是細胞系中使用的一種較佳的工具，它將允許您選擇的指示劑在細胞系中穩定表達?；蚓幋a報告系統的一個(gè)潛在問(wèn)題是，并非所有細胞系都容易被轉導?！　?/span>

　　在用ADP 進(jìn)行激動(dòng)劑治療期間，人腸道類(lèi)器官單層的實(shí)時(shí)、短期成像。這些有機體單層以綠色表達鈣指示劑 GCaMP6s。ADP 是一種已知的激動(dòng)劑，用于在細胞中引發(fā)細胞內鈣信號傳導。激動(dòng)劑治療是測試治療劑量反應的較的好方法。

　　2.成像長(cháng)度

　　對于活細胞成像，時(shí)間長(cháng)度和間隔是需要記住的重要參數。細胞成像過(guò)程中的主要關(guān)注的是光漂白和光毒性。應避免持續使用激發(fā)光，重要的是選擇足夠強的曝光時(shí)間和光功率，以檢測鈣信號，但不要過(guò)強，以免對細胞造成損害。成像的長(cháng)度將取決于實(shí)驗。對于測試激動(dòng)劑或細胞反應，這通常是5-20分鐘的較短成像運行，每1-2秒捕獲一次圖像。對于研究傷口修復或病毒感染期間鈣信號傳導的實(shí)驗，我們會(huì )在18-20小時(shí)內成像，每分鐘捕捉一次圖像?！　?/span>

　　活細胞成像的技巧

　　考慮要使用的細胞系是很重要的。為了研究鈣動(dòng)力學(xué)，使用形成單層的細胞系將確保感興趣的區域保持聚焦，以捕捉信號動(dòng)力學(xué)，從而獲得較佳質(zhì)量的視頻和清晰的量化。對于涉及細胞間通訊和鈣動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗，細胞系融合也是一個(gè)重要的考慮因素。為了獲得質(zhì)量的圖像，選擇合適的載玻片非常重要。有些細胞培養物更喜歡玻璃載玻片而不是光學(xué)級塑料載玻片，因此最好測試腔室載玻片。我們的細胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室載玻片?！　?/span>

μ-Slide 8 Well high（貨號： 80806）

　　活細胞成像是使細胞的密度允許形成一個(gè)融合的單層，但不會(huì )導致細胞過(guò)度擁擠和團塊。在成像過(guò)程中需要使用合適的培養基。許多傳統的細胞培養基含有酚紅，它可引起高背景熒光。這使得在成像過(guò)程中很難從背景噪聲中分離出真實(shí)信號。因此，重要的是用PBS洗滌細胞，并用無(wú)酚紅培養基或市售的用于活細胞成像的培養基代替培養基?！　?/span>