ibidi3孔可移除腔室載玻片可對MCF-7細胞進(jìn)行培養、固定和染色，為其免疫熒光實(shí)驗提供一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟高效的方案。

　　實(shí)驗使用材料：　　

　　此次實(shí)驗所需使用的材料和試劑如下所示。此外，還需要配備一臺有適當濾光片組的倒置或正置熒光顯微鏡?！　?/p>

　　·3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）　　

　　·3孔可移除培養專(zhuān)用圓形15mm蓋玻片及配套工具，（ibidi，10815）　

　　·細胞：MCF-7（CLS，300273）　　

　　·細胞培養基　　

　　·細胞培養試劑　

　　·PBS　　

　　·福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）　

　　·染色試劑：DAPI（Sigma，D954）、DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）　

　　·封片劑：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）

　　實(shí)驗操作解決方案：細胞培養，固定，染色和成像觀(guān)察--都是在一個(gè)開(kāi)放型小室中搞定：　　

　　第1步：必須在預實(shí)驗中確定細胞系的正確接種濃度。根據您的細胞類(lèi)型，用2-6x104細胞/ml在2-3天內產(chǎn)生匯合的單層?！　?/p>

　　1. 在無(wú)菌條件下，打開(kāi)3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）包裝?！　?/p>

　　2. 像往常一樣對細胞進(jìn)行胰蛋白酶化和計數。MCF-7細胞濃度為3×104細胞/ml ?！　?/p>

　　3. 將1100μl細胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因為這會(huì )導致細胞分布不均勻。為獲得更均勻的細胞分布，請使用3孔可移除培養專(zhuān)用圓形15mm蓋玻片?！　?/p>

　　4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養?！　?/p>

　　5. 細胞至少培養24小時(shí)，或直到建立融合的單層?！　?/p>

　　第2步：固定是染色程序的第一步。目的是將細胞、細胞結構或組織維持在當前狀態(tài)，并通過(guò)化學(xué)試劑在較長(cháng)時(shí)間內保存制劑?！　?/p>

　　1.小心地抽吸細胞培養基?！　?/p>

　　2.用PBS洗兩次?！　?/p>

　　3.加入1100μl福爾馬林溶液?！　?/p>

　　4.室溫下孵育30分鐘?！　?/p>

　　5.小心地抽吸福爾馬林溶液?！　?/p>

　　6.用PBS洗滌三次　　

　　第3步：應根據感興趣的細胞結構選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細胞的細胞核和肌動(dòng)蛋白骨架?！　?/p>

　　1.準備你的染色溶液：PBS、DYE-490鬼筆環(huán)肽（每單元/玻片，50 μl/單元）、DAPI 1μg/ml　　

　　2.小心吸出PBS?！　?/p>

　　3.用蓋玻片拾取工具抓取15毫米的圓形蓋玻片，并將其放置在腔室孔內的圓形邊緣上?！　?/p>

　　4.將移液管-尖-端-插入其中一個(gè)角槽中，將150μl染色液移入孔中?！　?/p>

　　5.在室溫下避光孵育30分鐘　　

　　第4步：染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號　　

　　1.通過(guò)在一個(gè)角槽中添加950μl緩沖液來(lái)移除蓋玻片?！　?/p>

　　2.用Coverslip Pick-Up Tool蓋玻片拾取工具或鑷子抓取漂浮的蓋玻片，將其從孔中取出?！　?/p>

　　3.如有必要，重復洗滌步驟，抽吸緩沖液并在每孔中移液1100μl緩沖液。圓形的15毫米蓋玻片無(wú)需額外的洗滌步驟?！?/p>

　　第5步：從一個(gè)邊緣開(kāi)始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應以緩慢，穩定的進(jìn)行，以避免損壞細胞層。

　　第6步：完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水?！　?/p>

　　1.將載玻片側面在干凈的實(shí)驗室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)?！　?/p>

　　2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到封片劑上，以避免夾住任何氣泡?！　?/p>

　　Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)?！　?/p>

　　3.等封片劑固定好。

　　第7步：顯微觀(guān)察　　

　　使用可移除3孔腔室載玻片培養MCF-7細胞。用DAPI和染料490對細胞結構進(jìn)行染色。圓形15mm蓋玻片減少了所需的染色溶液的量。用硬化封片劑安裝載玻片，可使樣品長(cháng)期保存?！　?/p>

　　圖1 MCF-7細胞的肌動(dòng)蛋白骨架用DYE 490鬼筆肽染色（左上），細胞核用DAPI染色（右上）。下圖顯示了合成圖像，細胞核為藍色，肌動(dòng)蛋白骨架為綠色。（比例尺：100μm）

　　訂購信息：