活細胞成像可用來(lái)研究周?chē)窠?jīng)系統細胞和用于組織重建的各種生物材料之間的相互作用，不僅可看到細胞的實(shí)時(shí)快照還可看到細胞活動(dòng)?；罴毎上袷乾F代細胞培養中最引人入勝的技術(shù)之一。

　　1、確保您擁有合適的細胞培養小室　　

　　首先，您需要確定哪些因素具有視覺(jué)意義。您只是想可視化您的細胞遷移嗎？或者您是否想研究您的細胞是否將遷移方向改變?yōu)樘囟ǖ纳L(cháng)因子？有多種細胞培養室可用于活細胞成像，特別是ibidi提供了各種*適合您需求的選項。例如， µ-Slide Chemotaxis chambers 細胞趨化載玻片（圖1）通過(guò)提供允許添加各種因素的細胞室來(lái)實(shí)現實(shí)時(shí)趨化性測量。細胞被接種在兩室的中間，并且可以分析細胞優(yōu)先地遷移到哪一側。大多數情況下，我們使用µ-Slide 4 Well用于我們的活細胞成像實(shí)驗，因為它們較大的區域允許在一個(gè)孔中觀(guān)察多個(gè)位置。另一種選擇是µ-Slide 4 Well ph+，它有一個(gè)特殊的中間擋板，可實(shí)現相差和熒光顯微鏡的出色圖像。有許多不同的腔室可供選用，其中有一些我們還沒(méi)有嘗試過(guò)，但將來(lái)肯定會(huì )嘗試。如果您有使用任何其他腔室載玻片的經(jīng)驗以及如何使用它們的，請告知我們！

　　圖1) ibidi µ-Slide Chemotaxis

　　2、關(guān)于細胞：周密計劃您的樣品制備　　

　　接下來(lái)，重要的是要考慮如何準備細胞。根據細胞類(lèi)型、移動(dòng)速度和數量增長(cháng)速度，需要確定各種參數。例如，Schwann細胞需要一些時(shí)間來(lái)沉淀，因此在接種后幾小時(shí)開(kāi)始活細胞成像實(shí)驗是有意義的。此外，一些細胞往往會(huì )受到細胞間接觸的影響，因此重要的是要考慮正確的細胞播種數，不同的研究的對象存在差異。因此考慮不同的細胞接種數量是很重要的。最后，決定細胞是否需要額外的包被也很重要。

　　3、讓您的細胞在顯微鏡下保持活力和快樂(lè )　

　　一旦細胞準備好，我們就可以去顯微成像。不幸的是，并非所有顯微鏡都可用于活細胞成像。重要的是，它們得配備一個(gè)內置的培養箱，可調節CO2的濃度和溫度，以保持細胞存活。我們將奧林巴斯 IX83 與ibidi Stage Top Incubation System加熱孵育系統結合使用（見(jiàn)圖 2）。它為我們提供了對溫度和CO2以及濕度的精確控制。我們通常在 37°C 和 5% CO2、 50%濕度的恒定溫溫下進(jìn)行活細胞成像實(shí)驗。有兩種不同的加熱板可供選擇，一種用于單腔載玻片，另一種用于一次對四個(gè)腔載玻片進(jìn)行成像，非常適合大量實(shí)驗。

　　圖2) ibidi Stage Incubation System加熱孵育系統

　　4、選擇合適的顯微鏡和錄制設置　　

　　把腔室載玻片固定在加熱蓋下的板上，就可以開(kāi)始實(shí)驗了。需要考慮的重要事項是顯微鏡的放大倍率、系統應該多久拍照一次以及拍攝多長(cháng)時(shí)間。例如，由于Schwann細胞是快速移動(dòng)的細胞，因此使用比成纖維細胞更低的放大倍數是意義的，成纖維細胞的移動(dòng)速度要慢得多，遷移距離更短。我們使用cellSens Olympus Corporation軟件每10分鐘拍攝一張照片，持續至少10小時(shí)，這個(gè)是為與細胞速度和覆蓋距離相關(guān)的遷移實(shí)驗的而做的良好設置。如果您對細胞如何移動(dòng)或對截然不同的事物感興趣，例如細胞如何吸收粒子，則縮短拍攝照片之間的時(shí)間可能是有意義的。

　　5、通過(guò)分析數據量化實(shí)驗　　

　　實(shí)驗結束后，在我們的案例中，軟件呈現的。vsi 文件，我們通常會(huì )將這些文件轉換為。avi視頻和。tiff 圖像序列。然后，使用ImageJ，我們使用手動(dòng)跟蹤插件通過(guò)跟蹤并單擊每一幀中的單個(gè)單元格來(lái)跟蹤選定的單元格。每個(gè)單元格都有單獨的遷移路徑。然后，使用 ibidi Chemotaxis and Migration Tool評估結果，該工具可以計算平均速度、平均總距離和有效距離，以及每個(gè)單元格的方向性指數（見(jiàn)圖3）。

　　圖3：ibidi Chemotaxis和遷移工具插件的界面

　　最后，您可以從中獲得令人驚嘆的數據！