ibidi血管生成實(shí)驗實(shí)驗裝置優(yōu)化和數據分析操作

　　µ-Slide 血管生成載玻片

　　1.選擇正確實(shí)驗方案　　

　　進(jìn)行血管形成分析的第一步是確定實(shí)驗方案。需要考慮三個(gè)最重要的考慮因素，分別是：　　

　　· 細胞類(lèi)型——內皮細胞中生理性地觀(guān)察到管形成　

　　· 凝膠基質(zhì)——它需要與細胞相容，并且必須為細胞附著(zhù)提供結合基序　　

　　· 培養基成分（要求生長(cháng)因子）　

　　2.實(shí)驗前工作　　

　　在開(kāi)始篩選實(shí)驗之前，務(wù)必要做優(yōu)化實(shí)驗程序和設置。

　　2.1. 實(shí)驗裝置的優(yōu)化　　

　　細胞接種密度、數據采集時(shí)間點(diǎn)和血清濃度對數據值有很大影響。因此，創(chuàng )建嚴格對于生成可重復的數據和數據集之間的可比性至關(guān)重要。

　　2.1.1. 測量時(shí)間間隔

　　首先，選擇細胞濃度和促進(jìn)血管形成的設置來(lái)記錄時(shí)間曲線(xiàn)。對于人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 每孔約 10,000 個(gè)細胞，使用具有減少生長(cháng)因子的基質(zhì)膠TM值和不含血清或生長(cháng)因子的細胞培養基就足夠了。

　　接下來(lái)，按照應用說(shuō)明制備凝膠和細胞懸液，“ibidi µ-Slide 血管生成的形成分析"。在凝膠表面播種細胞后，立即將載玻片放入顯微鏡的培養室中，并開(kāi)始延時(shí)記錄。每 10 分鐘記錄一張圖像，使用基于軟件的工具在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)調整焦點(diǎn)?；蛘?，如果您的顯微鏡上沒(méi)有孵化室，則每小時(shí)記錄一次圖像，至少在前 8 - 10 小時(shí)內。記錄每個(gè)圖像后立即將樣品放入細胞培養箱中。在過(guò)夜培養后記錄最終圖像。

　　最后，分析圖像并使用合適的軟件可視化曲線(xiàn)。參數（例如，總管長(cháng)）的時(shí)間曲線(xiàn)通常如下圖所示。曲線(xiàn)上升到最大值（約 5 小時(shí)），然后下降到平均期（約 7 小時(shí)開(kāi)始），然后慢慢變平（> 20 小時(shí)）。由于所有四個(gè)關(guān)鍵參數的特征看起來(lái)相似，只評估一個(gè)參數就足夠了。我們選擇管總長(cháng)度作為參數，因為原始圖像提供了一個(gè)控制，可以輕松地與評估圖像進(jìn)行比較。

　　24小時(shí)內管長(cháng)的時(shí)間響應

　　最佳結果出現在最大階段以及不會(huì )迅速下降的穩定階段。在上例中，4 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)和 10 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)是很好的測量參考點(diǎn)。

　　2.1.2. 細胞接種密度　　

　　要確定最佳細胞接種密度，請記錄細胞系的特征。

　　首先，在 5-40 x 10 3cells/ml 范圍內進(jìn)行一系列稀釋?zhuān)缓髮⒓毎臃N到凝膠表面。按照第 4.1.1 節中的說(shuō)明將樣品孵育確定的時(shí)間長(cháng)度，并記錄相襯圖像。每個(gè)細胞濃度執行五次重復。

　　評估圖像，分別在第 3 節和第 5 節中提到。將數據可視化為圖表，如下所示。數據將顯示具有最大值的特性曲線(xiàn)。該最大值是您的細胞類(lèi)型的*佳接種密度。

　　HUVEC 和 EA.hy926接種4小時(shí)后的密度響應

　　2.1.3. 血清濃度　　

　　向培養基中添加血清可能會(huì )影響試管形成行為。在大多數情況下，血清抑制管形成。為避免此問(wèn)題，請使用您在第 4.1.1 節和第 4.1.2 節中確定的條件測試不同的血清濃度，范圍為 0 - 20%。這將確定哪種血清濃度適合于血管生成和細胞存活。

　　2.1.4. 放大倍數　　

　　放大倍數決定了能夠被相機成像的孔區域。由于管的形成發(fā)生在孔的整個(gè)表面區域，重要的是盡可能地對最寬的部分進(jìn)行成像。如果不需要檢測細胞內細節，請使用低倍率（4 倍或 5 倍）。如果需要檢測細胞內細節，建議對每個(gè)孔拍攝幾張放大倍數更高的圖像并將它們拼接在一起

　　2.2. 建立陽(yáng)性和陰性對照　　

　　要創(chuàng )建陽(yáng)性對照，請選擇確保血管形成的實(shí)驗系統（例如，具有減少生長(cháng)因子的基質(zhì)膠TM值和用于 HUVEC 的無(wú)血清培養基）。陽(yáng)性對照確保細胞是健康的，并且觀(guān)察到的任何抗血管生成作用都是由所研究的物質(zhì)引起的。

　　要創(chuàng )建陰性對照，請選擇一種經(jīng)證實(shí)對血管形成發(fā)展具有抑制作用的物質(zhì)（例如，用于 HUVEC 的蘇拉胺）。陰性對照確?？梢砸种萍毎械墓苄纬?，并為您的實(shí)驗結果提供一個(gè)比較點(diǎn)。

　　2.3. 實(shí)驗計劃和重復次數　

　　在進(jìn)行實(shí)驗之前，計算所需材料的數量，例如細胞、培養基、凝膠基質(zhì)和物質(zhì)。還要計算實(shí)驗室設備和空間要求以及時(shí)間表。

　　為了正確地進(jìn)行統計分析，建議至少進(jìn)行四次獨立實(shí)驗，每個(gè)實(shí)驗至少有 8 個(gè)單孔。所需的實(shí)驗次數取決于數據的均勻性。遵循嚴格的協(xié)議對于數據采集至關(guān)重要。

　　對數據集執行學(xué)生 T 檢驗。p 值 ≤ 0.05* (≤ 0.01**) 表示該模型有足夠的功效，無(wú)需額外實(shí)驗即可繼續。

　　2.4. 文檔　　

　　合理的文檔包括本節中確定的所有參數。生成一個(gè)表格圖表，其中每個(gè)實(shí)驗都記錄在一列中。附錄中給出了一個(gè)例子。

　　3.數據分析

　　每個(gè)分析孔生成一個(gè)管長(cháng)度值。然后將一個(gè)實(shí)驗（每個(gè)條件至少 8 個(gè)孔）的值相加并計算標準偏差。標準偏差應小于 10%。這只是一個(gè)實(shí)驗數據點(diǎn)。

　　左圖顯示了在四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，一種實(shí)驗條件下單孔結果的分布。右圖顯示了一種實(shí)驗條件在四個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的平均結果。

　　為了正確穩定的統計分析，每個(gè)條件至少需要四個(gè)數據點(diǎn)。請記住，每個(gè)數據點(diǎn)由 8 個(gè)單獨的孔組成?！　?/p>

　　單個(gè)數據點(diǎn)合并為一個(gè)平均值，并可以顯示在條形圖中。統計分析是通過(guò)學(xué)生 T 檢驗完成的，其中對不同的數據點(diǎn)群體進(jìn)行相互檢驗。