為了研究腫瘤微環(huán)境影響下腫瘤細胞的運動(dòng)性和侵襲特性，建立了體外2D侵襲方案。

　　2D侵襲方案是一種共培養試驗，在這種情況下，是由腫瘤和基質(zhì)細胞（例如成纖維細胞）組成的。一旦兩種細胞類(lèi)型接觸，在不同的條件下評估侵襲成纖維細胞單層的腫瘤細胞的數量，在我們的研究中，我們在模擬實(shí)體腫瘤微環(huán)境中發(fā)現的條件，例如與基質(zhì)細胞（成纖維細胞）的相互作用以及成纖維細胞釋放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我們使用A375黑色素瘤細胞系和真皮成纖維細胞進(jìn)行了此測定。黑色素瘤細胞激活成纖維細胞，繼而維持腫瘤細胞的生長(cháng)，惡性轉化和耐藥性（Flach等，2011）。然而，在刺激所測試的抗癌化合物后，我們發(fā)現與成纖維細胞直接接觸的黑素瘤細胞顯示出運動(dòng)能力受損并且未能侵襲成纖維細胞層。

　　ibidi腫瘤細胞2D侵襲檢測方案實(shí)驗流程：　　

　　01. 將GFP-A375和番茄成纖維細胞系穩定地保存在MEF培養基中，在37°C和5%C02加濕培養箱中?！　?/p>

　　02. 當細胞達到亞融合度（約80％融合度）時(shí)，在帶有PBS的通風(fēng)櫥中清洗它們，以去除死細胞和碎片?！　?/p>

　　03. 在培養箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化細胞約5分鐘，然后添加MEF培養基以阻止反應?！　?/p>

　　04. 將細胞懸浮液收集在15ml細胞培養管中，并用臺式離心機（1500xg,5′,RT）短暫離心?！　?/p>

　　05. 將細胞重新懸浮在新鮮培養基中；將一體積的細胞懸液與另一體積的臺盼藍溶液混合，用細胞計數器計數活細胞?！?/p>

　　06. 在MEF緩沖液中以4x105細胞/ml的濃度稀釋細胞?！　?/p>

　　07. 在多孔板上，在每個(gè)孔的中間放置一個(gè)Culture-Insert2孔（2孔培養插件）?！　?/p>

　　08. 用75µl（3x104細胞）FP-A375細胞填充插入物一側，并用番茄成纖維細胞填充另一側。用移液器上下混合插入物中的細胞，以確保細胞*分布?！　?/p>

　　09. 將多孔板放在培養箱中，放置過(guò)夜?！　?/p>

　　10. 第二天，在鑷子的幫助下，小心地從每孔中取出培養基和插件，并用PBS清洗?！　?/p>

　　11. 小心除去PBS，然后加入新鮮的MEF培養基?！?/p>

　　12. 用光學(xué)顯微鏡檢查GPF-A375與Tomto成纖維細胞之間產(chǎn)生的間隙的閉合狀態(tài)?！　?/p>

　　13. 一旦每個(gè)孔中的間隙*閉合，請使用熒光顯微鏡和成像軟件獲取熒光圖像。確保腫瘤細胞尚未侵入成纖維細胞單層?！?/p>

　　14. 小心地除去培養基，并在控制組孔中添加培養基+0.1％PBS，在處理組孔中添加培養基。將板放在培養箱中24小時(shí)（處理孵育時(shí)間）?！　?/p>

　　24小時(shí)后，在熒光顯微鏡下重新采集共培養孔，以評估治療組與對照組（綠色熒光細胞散布在紅色標記層上）的腫瘤細胞侵襲行為的任何變化。

　　將黑素瘤細胞和成纖維細胞共培養，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小時(shí)后，評估侵襲成纖維細胞層的腫瘤細胞的數目。A375細胞顯示出大規模的侵襲行為，受到MithramycinA治療的損害。比例尺：500μm。