在流體環(huán)境下細胞培養進(jìn)行粘附實(shí)驗,該應用描述了一種在流動(dòng)下的粘附試驗，該試驗旨在研究特定細胞表面分子的作用，以確定它們在細胞附著(zhù)和粘附到其他細胞類(lèi)型期間的潛在相互作用。

　　實(shí)驗流程　　

　　1.準備EOMA細胞稀釋液：根據制造商的說(shuō)明，使用非酶細胞解離溶液分離先前培養的EOMA細胞。使用血細胞計數器（Neubauerchamber）對細胞進(jìn)行計數。在EC培養基中將細胞稀釋至1.2x106個(gè)細胞/ml的濃度?！　?/p>

　　2.種入EOMA細胞：在3個(gè) µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA細胞稀釋液（每個(gè)µ-Slide1.75x105EOMA細胞），然后孵育3小時(shí)。

　　表1：實(shí)驗設置

　　3.啟動(dòng)流量：播種三小時(shí)后，將2個(gè)µ-Slides連接到流體單元FU，使用總量2.7毫升EC培養基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細胞表面的剪切應力設置為0.5dyn/cm2。測量流速并使用兩個(gè)FU的平均值來(lái)計算校準因子。提前孵育FU和連接的載玻片過(guò)夜。第三個(gè)帶有EOMA細胞的µ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒(méi)有任何流動(dòng)的情況下孵育它過(guò)夜。

　　4.準備MM細胞：根據制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培養基（不含FCS）中染色6x105MM細胞。標記后，離心細胞并使用血細胞計數器對其進(jìn)行計數。

　　5.開(kāi)始與MM細胞共培養：停止流動(dòng)并在無(wú)菌條件下從FU水庫中取出EC培養基。要開(kāi)始共培養，將RPMI培養基（含10%FCS）和EC培養基以1:1的比例混合，并填充該混合物總體積為2.5ml，其中含有1.5x105MM注入兩個(gè)FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統并繼續流動(dòng)24小時(shí)。

　　6.分子阻斷：將MM細胞添加到ECs后24小時(shí)，用100µg/ml抗體（載玻片 #2）或相應的同種型對照（載玻片 #1）處理細胞，將它們直接添加到FU，無(wú)需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動(dòng)狀態(tài)下24小時(shí)。

　　7.清洗和成像：從FU上斷開(kāi)µ-Slides。用PBS清洗細胞一次，以去除任何非貼壁細胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，以可視化附著(zhù)在EC層上的標記MM細胞。

　　圖1：與同種型對照處理（左圖）相比，阻斷特定表面分子（右圖）時(shí)，MM細胞對ECs的粘附性降低