1、哪種細胞密度適合應用實(shí)驗　

　　通常，我們建議每孔使用5,000-10,000個(gè)HUVEC。 但是，確定最佳細胞數對于使用µ-Slide血管生成從管形成測定中獲得最佳結果是至關(guān)重要。 細胞密度取決于細胞類(lèi)型和細胞大小。 因此，在開(kāi)始實(shí)際實(shí)驗之前，我們建議在非抑制條件下播種幾個(gè)細胞數并對管形成進(jìn)行成像。 然后，對于最佳測定條件，使用在您的實(shí)驗中產(chǎn)生最多管數的細胞密度。請記住，細胞通常不會(huì )在凝膠基質(zhì)上增殖。請參閱：血管生成實(shí)驗實(shí)驗裝置優(yōu)化和數據分析 |ibidi µ-Slide

　　2、應該在哪個(gè)時(shí)間段內觀(guān)察細胞　　

　　管形成的持續時(shí)間取決于細胞類(lèi)型和所使用的細胞外基質(zhì)，應單獨確定。 通常，HUVEC在 2-4小時(shí)后已經(jīng)形成管。24小時(shí)后細胞開(kāi)始發(fā)生凋亡，這導致從基質(zhì)中脫離和管破裂。請參閱：血管生成實(shí)驗實(shí)驗裝置優(yōu)化和數據分析 |ibidi µ-Slide

　　3、是否需要活細胞成像裝置來(lái)每小時(shí)拍攝管形成測定的照片　

　　非必須，通過(guò)顯微鏡對 µ-Slide 血管生成上的同一位置進(jìn)行一致和精確的成像。 可以使用顯示 x/y 坐標的顯微鏡載物臺或自動(dòng)載物臺來(lái)完成成像。 使用自動(dòng)化平臺，可以將孔的所有位置（特別是每個(gè)孔的中心）保存到位置列表中，您可以在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)訪(fǎng)問(wèn)相應的位置。

　　但是，使用完整的活細胞成像設置在顯微鏡上建立生理條件要方便得多。使用ibidi Stage Top 孵育系統等活細胞孵育裝置有助于在成像過(guò)程中提供穩定溫度和濕度條件，從而在體外可以直接進(jìn)行視頻拍攝。

　　4、是否可以使用 µ-Slide 血管生成在凝膠基質(zhì)內培養細胞　　

　　可以，µ-Slide 血管生成非常適合在精確定義的3D基質(zhì)中培養細胞。由于大界面的凝膠和頂部細胞培養基，凝膠中的條件可以通過(guò)更換上部?jì)σ浩髦械慕橘|(zhì)來(lái)調整。

　　5、應該在管形成實(shí)驗中使用含酚紅的凝膠還是不含酚紅的凝膠　　

　　對于使用µ-Slide血管生成的管形成測定中的相差顯微鏡，酚紅不會(huì )干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。然而，當使用熒光顯微鏡時(shí)，酚紅可能會(huì )干擾探頭的波長(cháng)。在這種情況下，最好使用無(wú)酚紅凝膠。

　　6、是否需要將µ-Slide Angiogenesis血管生成載玻片放入培養箱的濕室中進(jìn)行凝膠聚合

　　我們建議將µ-Slide血管生成載玻片放入加濕腔中進(jìn)行凝膠聚合。 雖然反應室對于聚合本身不是必需的，但它可以最大限度地減少蒸發(fā)的影響。 在高流量孵化器中，防止蒸發(fā)的足夠百分比的濕度可能不會(huì )始終保持一致。 µ-Slide血管生成中的少量凝膠會(huì )很快變干，這會(huì )導致彎液面的形成。

　　7、胎牛血清 (FBS) / 胎牛血清 (FCS) 濃度是否會(huì )影響管形成實(shí)驗中的管形成和降解速率　　

　　一般是的。 這取決于所使用的細胞類(lèi)型或細胞系。 當提供濃度高達 10% FCS 的細胞培養基時(shí)，我們在 µ-Slide 血管生成中觀(guān)察到典型的原代細胞 (HUVEC) 管形成和 Matrigel® 上的幾種內皮細胞系。 但是，我們建議分別優(yōu)化每個(gè)細胞系的 FBS/FCS 濃度。

　　8、您是否推薦使用減少生長(cháng)因子的 Matrigel® 進(jìn)行管形成分析　

　　對于使用µ-Slide血管生成的管形成測定，我們使用了減少生長(cháng)因子的 Matrigel® 和未減少的 Matrigel®。

　　9、我們希望使用減少了生長(cháng)因子的 Matrigel® 和無(wú)血清培養基以及 50 ng/ml VEGF。 這足以刺激管的形成嗎　　

　　可以，這種組合足以刺激ibidi血管生成實(shí)驗室器皿中的管形成，而培養基中沒(méi)有任何額外的生長(cháng)因子。

　　10、除了 Matrigel® 之外，您在試管形成實(shí)驗中是否有使用其他凝膠的經(jīng)驗　　

　　原則上，任何凝膠都可用于µ-Slide血管生成管形成實(shí)驗。 細胞可以附著(zhù)在表面上是很重要的。 膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白為細胞粘附提供了重要的結合基序。

　　11、什么是管形成實(shí)驗合適的陽(yáng)性和陰性對照　　

　　建議使用陽(yáng)性和陰性對照來(lái)減少管形成實(shí)驗中的變量。陽(yáng)性對照是預期細胞在其中形成血管的樣本（取決于實(shí)驗設置），從而向研究人員表明該實(shí)驗已正確進(jìn)行。陰性對照是與所有其他樣品以相同方式處理的樣品，但預計不會(huì )顯示任何實(shí)驗結果（例如，很少或沒(méi)有管形成）。

　　ibidi血管生成實(shí)驗室器皿中管形成實(shí)驗的最佳陽(yáng)性和陰性對照很大程度上取決于所使用的細胞、凝膠基質(zhì)和一般實(shí)驗設置。因此，我們建議您查閱文獻，了解您感興趣的主題中成功使用的對照（陽(yáng)性和陰性對照）。

　　在下文中，您可以找到管形成測定中陽(yáng)性和陰性對照的可能方法：

　　如果需要分析特定化合物誘導血管生成的效力，則可以使用用已知血管生成誘導劑（例如 VEGF 或 FGF2）處理的樣品作為陽(yáng)性對照。濃度很大程度上取決于細胞類(lèi)型和實(shí)驗設置。

　　如果使用原代細胞，預篩選的內皮細胞系（例如，HUVEC）在用特定生長(cháng)因子處理后表現出明確的反應，可以作為陽(yáng)性對照。

　　對于某些細胞類(lèi)型，形成管的能力還取決于所使用的凝膠基質(zhì)。作為陽(yáng)性對照，內皮細胞應在含有饑餓培養基（不含生長(cháng)因子或血清的培養基）的生長(cháng)因子減少的 Matrigel®上顯示管形成。如果需要測試促血管生成物質(zhì)，則使用饑餓培養基尤其重要，因為大多數細胞培養基都添加了生長(cháng)因子。為了分析物質(zhì)的真實(shí)效果，基質(zhì)和培養基都必須不含任何生長(cháng)因子。作為陰性對照，細胞可以播種在不同的基質(zhì)（例如膠原蛋白 I）上，預計不會(huì )形成管狀。

　　不影響細胞活力的管形成抑制劑（例如，蘇拉明或蘿卜硫素）可用作陰性對照。如果實(shí)驗的目的是測試抗血管生成物質(zhì)，則使用這種類(lèi)型的抑制劑尤其重要。

　　如果用任何溶解的物質(zhì)（例如，在 DMSO 或乙醇中）處理細胞，則僅使用溶劑作為陰性對照。

　　12、是否有用于分析管形成實(shí)驗的推薦染色方案　

　　一般來(lái)說(shuō)，相差顯微鏡足以自動(dòng)分析 µ-Slide血管生成中的標準管形成實(shí)驗。 但是，如果您想研究某種標記，您可以應用您的標準方案（例如，用于免疫熒光染色），但要小心，以免損壞凝膠基質(zhì)或細胞網(wǎng)絡(luò )。

　　13、在開(kāi)始實(shí)驗之前，我是否必須將 ibidi 血管生成實(shí)驗室器皿平衡到 37°C　　

　　不，不需要平衡 µ-Slide 血管生成。 在室溫下儲存，可以立即用凝膠基質(zhì)填充。 由于µ-Slide 的開(kāi)孔形式，加熱時(shí)從凝膠中逸出的氣體可以與大氣自由交換。

　　14、完成實(shí)驗后，µ-Slide Angiogenesis和µ-Plate Angiogenesis 96 Well可以重復使用嗎　

　　不可以，µ-Slide血管生成載玻片和µ-Plate血管生成96孔板是一次性耗材，僅供一次性使用。

　　15、µ-Slide 血管生成是否有96孔版的　

　　有。 µ-Plate血管生成96孔板具有與µ-Slide血管生成相同的“孔中孔"設計和凝膠體積 (10 µl)。 µ-Plate血管生成96孔可用作高通量管形成實(shí)驗的篩選板，具有*的ANSI/SLAS (SBS) 和robotics兼容性